红曲霉原生质体的制备、再生及其遗传转化系统

原生质体是研究和建立真菌遗传转化系统的重要工具。为了建立原生质体介导的红曲霉遗传转化系统,考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对红曲霉原生质体形成和再生的影响。将红曲霉分生孢子在铺有玻璃纸的平板上30℃培养30～40h收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放。红曲霉菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为:0.3%lysingenzyme、0.1%cellulase和1%snailase的酶组合,30℃作用2.5h;最适渗透压稳定剂是:1mol/LMgSO4。最适合原生质体再生的培养基为含0.6mol/L蔗糖的CM培养基。原生质体液涂布单层再生培养基的方法,再生率最高,菌株M34和N18分别为8.5%和36.4%。在PEG和CaCl2存在下,以潮霉素B为抗生素选择标记,用质粒pBC Hygro和pNL1共转化菌株M34原生质体,每微克DNA可获得100个稳定转化子。

树状多节孢原生质体的制备和再生

研究了酶系组成、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂、pH值、培养基成分、培养方式、预处理、保护剂等因素对紫杉醇产生菌树状多节孢原生质体制备和再生的影响 .结果表明 :将树状多节孢在PDA液体培养基中静止培养 2～3d ,离心收集菌体 ,用 pH 5 .5～ 6 .0的 0 .7mol/L的NaCl配制成的含有 3%纤维素酶、2 %蜗牛酶和 1%溶菌酶的复合酶 ,30℃恒温酶解 9h ,原生质体制备率最高。但是考虑到原生质体的再生 ,以酶解 7h左右为宜 .获得的原生质体经过纯化 ,用 0 .7mol/LNaCl配制的PDA再生培养基进行双层平板培养法再生 ,原生质体的再生率最高 .本研究为以后通过原生质体诱变、转化、融合构建紫杉醇工程菌株奠定了基础 .图 3表 9参

果胶酶产生菌ZH-g的原生质体形成与再生研究

本文通过研究酶浓度、酶的作用时间、菌龄、菌体预处理等不同因素对原生质体形成与再生的影响,得出了果胶酶产生菌ZH-g原生质体制备和再生的最佳条件:加入0.6μg/ml的氨苄青霉素进行菌体预处理,选用对数生长期的菌株,以1.2mg/ml溶菌酶37℃保温处理2h,原生质体形成率为92%,再生率达50.7%。

微生物原生质体制备及再生的影响因素

原生质体的制备及再生,是原生质体技术的前提和基础。本文较全面地介绍了影响微生物原生质体制备及再生的因素,以期在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体,为进一步实验打下良好的基础。

柱晶白霉素产生菌的原生质体制备、再生和诱变

目的 :对柱晶白霉素产生菌 SK-0 6的原生质体制备和再生的条件 ,以及再生菌的产生抗生素能力进行了研究。方法 :考察甘氨酸浓度对菌丝生长的影响 ,摸索和确定溶菌酶酶解的最佳条件 ,考察再生培养基的组成。结果 :溶菌酶酶解的最佳条件为 :2 mg/ml、30℃、90 min。再生率达到 1 5 %。通过二次再生后 ,获得了一株高产菌株 ,效价提高了 2 38%。经过紫外线诱变的孢子和原生质体的效价提高了 95 %和 1 6 0 %。结论 :原生质体制备和再生选育高产菌株是一种有效的菌种选育手段。

保加利亚乳杆菌原生质体的制备与回复研究

目的 :通过对保加利亚乳杆菌的原生质体的制备和回复的方法学探讨 ,为乳杆菌的基因操作和其相关研究提供技术思路和实验条件。方法 :用酶浓度分别为 1μg/ml、4 μg/ml、10 μg/mlMutanolysin(变溶菌素 )对保加利亚乳杆菌进行处理 ,脱去细胞壁以探讨其原生质体形成与时间和酶浓度的关系 ;并选用较为适宜的酶浓度制备其原生质体 ,在自制的双层再生培养基上观察其原生质体在普通培养、CO2 培养、厌氧培养时的回复生长情况。结果 :保加利亚乳杆菌对Mutanolysin较敏感 ,酶浓度为 1μg/ml时只需 4 0min大部分菌体形成原生质体。经 1μg/mlMutanolysin处理后制得的保加利亚乳杆菌原生质体倾入自制的双层再生培养基中 ,置于CO2 和厌氧环境条件下培养能很好的回复生长。结论 :本文的研究为乳杆菌的基因工程方面的研究提供了相关的技术条件和实验基础。

面包酵母原生质体的制备、再生及紫外线诱变的初步研究

对面包酵母原生质体制备、再生的适宜条件进行了研究 ,并对原生质体进行了扫描电镜观察和紫外线诱变。结果表明 :对数生长早期的细胞较易形成原生质体 ,用 1%蜗牛酶 +0 1% β—巯基乙醇酶解 6 0min、90min ,原生质体的形成率分别为 88%、97% ,再生率分别为 4 31%和 0 4 % ;用 0 6mol/L甘露醇作渗稳剂时 ,原生质体的再生效果最佳 ,0 5mol/L蔗糖次之。电镜观察表明酵母菌的细胞壁是逐步被降解的。通过紫外线诱变原生质体获得了 1株高产CO2 菌株C35,该菌株发酵力比原始菌株提高了 2 5 3% ,表明利用原生质体进行诱变育种是可行的。

1株产酸性α-淀粉酶黑曲霉原生质体制备和再生条件优化

通过单因素试验、Plackett-Burman(PB)试验和响应面优化获得产酸性α-淀粉酶黑曲霉孢子原生质体制备和再生的最佳工艺参数:黑曲霉种龄72 h、孢子浓度7.5×106CFU/mL、渗透压稳定剂甘露醇浓度0.85 mol/L,以10 g/L蜗牛酶+10 g/L纤维素酶+10 g/L溶菌酶为破壁酶、pH 6.8、酶解温度37℃、酶解2 h。在此条件下,原生质体制备率可达86.92%,再生率可达42.67%。

青稞酒曲中酿酒酵母与假丝酵母原生质体形成与再生条件的研究

本实验通过研究酶种类、菌龄、酶浓度及酶的作用时间、菌体预处理及渗透压稳定剂等不同因素对原生质体形成与再生的影响,得出了青稞酒曲酵母ZY2,ZY8原生质体制备和再生的最佳条件:酵母ZY2在菌龄为10h,0.1mol/LEDTA+0.1%β-巯基乙醇为预处理剂作用10min;30℃下用1.5%的蜗牛酶酶解1h;酵母ZY8在菌龄为10h,0.1mol/LEDTA+20mmol/L2-硫苏糖醇混合于蜗牛酶1.5%+溶壁酶1%的酶解体系中,30℃下酶解1h;配制酶解液时渗透压稳定剂采用0.7mol/LKC1,在稀释及配制再生培养基时采用17%蔗糖的条件下,酵母ZY2形成率达94.15%,再生率达13.85%;酵母ZY8形成率达88.78%,再生率达23.02%。

产类胡萝卜素酵母菌原生质体的制备、再生与诱变

研究了1株产类胡萝卜素红酵母Y-35的原生质体最佳制备条件和再生条件,以及在此基础上的诱变育种。通过实验,初步确定Y-35菌株原生质体形成和再生的适宜条件为:菌龄16h、蜗牛酶浓度1%、30℃处理60min。红酵母Y-35原生质体经紫外线诱变后得到18株诱变菌株,分别测定其生物量、类胡萝卜素含量及产量,获得2株类胡萝卜素产量明显提高的变异菌株RY-10和RY-19,其产量分别比出发菌株提高49%和54%。

黑曲霉Ni-5k原生质体的制备和再生

研究不同配比的酶解液、菌丝的菌龄、酶处理的温度和时间、培养方法及其他因素对黑曲霉(A sp erg illus n ig er)N i-5k原生质体的形成量和再生率的影响,结果表明,酶解液浓度1.0%(其中含纤维素酶0.7%,蜗牛酶0.2%,溶菌酶0.1%),菌龄18 h、酶解温度30°C、酶解时间3 h,原生质体的形成量达到106个/mL;采用双层平板法于32°C再生,再生率达39%。

海洋低温蛋白酶生产菌YS-9412-130原生质体的制备与再生

以海洋低温蛋白酶生产菌株YS-9412-130为研究对象,从传代、菌龄、溶菌酶浓度与酶解时间、甘氨酸与EDTA预处理以及稳定剂对该菌原生质体形成与再生的影响进行研究。结果表明,在相同条件下,第一代菌至第五代菌原生质体的形成率分别为86.9%、70.3%、66.8%、63.4%、60.2%,再生率分别为10.5%、18.6%、17.9%、18.2%、17.8%;取该菌对数生长前期、对数生长中后期、稳定期部分菌液制备原生质体,原生质体的形成率分别为72.1%、70.4%、60.5%,再生率为13.4%、18.9%、10.4%;溶菌酶浓度为2.5 mg/mL5、mg/mL1、0 mg/mL、20 mg/mL,酶解60 min,原生质体的形成率分别为40.6%、70.8%、81.8%、95.6%,原生质体的再生率为19.0%、19.2%、19.0%、10.6%;使用10 mg/mL溶菌酶酶解YS-9412-130菌30 min、60 min、90 min、120 min,原生质体的形成率分别为30.8%、81.3%、81.7%、82.9%,原生质体的再生率分别为19.2%、19.3%、16.9%、11.2%;在细菌培养液中添加终质量浓度为5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL的甘氨酸,培养该菌16 h后制备原生质体,原生质体的形成率分别为81.0%、81.1%、90.3%、90.8%、90.6%,再生率为19.1%、19.0%、19.3%、12.0%、9.0%;EDTA对原生质体的形成稍有促进作用,但作用超过30 min会影响原生质体的再生;分别以0.6 mol/L KCl、0.3 mol/L KCl+0.3 mol/L蔗糖、0.6 mol/L蔗糖作为稳定剂,原生质体的再生率分别为10.9%、19.6%、25.9%。结论认为,YS-9412-130原生质体制备的最佳条件为选用第2代YS-9412-130菌,在培养基中添加终质度浓度为10 mg/mL的甘氨酸培养16 h后,再将菌体置于含有0.05 mol/L EDTA的高渗溶液中30℃预处理30 min,用10 mg/mL溶菌酶,30℃酶解60 min,再用0.6 mol/L蔗糖作为原生质体再生培养稳定剂,比较适合于YS-9412-130原生质体的制备与再生。这一试验结果将为通过原生质体技术对YS-9412-130菌进行遗传改良提供重要参数。[中国水产科学,2006,13(1):106-111]

马克斯克鲁维酵母原生质体制备和再生条件的研究

研究了菌龄、酶解温度、酶解时间、酶浓度4个单因素对马克斯克鲁维酵母原生质体形成率和再生率的影响,采用菌龄、酶解温度、酶解时间、酶浓度、稳渗剂进行5因素4水平的正交试验,分析各因素的极差值,评价各因素的影响程度。结果表明,酶浓度的极差值最高,其次为酶解时间,然后依次为菌龄、稳渗剂、酶解温度,酶浓度为影响原生质体形成的主要因素,原生质体形成和再生的最佳条件为:菌龄为12h,蜗牛酶浓度为1.5%,酶解时间为1h,酶解温度为28℃,稳渗剂为KCl,在此条件下,原生质体形成率为92.3%,再生率为29.6%。

双歧杆菌原生质体的制备与回复研究

进行了双歧杆菌原生质体的制备与回复相关技术研究 ,为其基因操作及相关研究提供技术基础。采用浓度分别为 1 ,5 ,1 0mg/LMutanolysin(变溶菌素 )对长双歧杆菌进行脱壁处理 ,以探讨其原生质体形成与时间和酶浓度的关系 ,然后选用较适宜的酶浓度 ( 5mg/LMutanolysin)制备其原生质体 ,并将其倾入自制的双层再生培养基上 ,观察其在不同环境条件下培养时的回复生长情况。结果表明 ,长双歧杆菌的细胞壁对Mu tanolysin较为敏感 ,用浓度为 5mg/L的Mutanolysin处理长双歧杆菌 40min ,在普通光学显微镜下即可见90 %的原生质体形成 ,当Mutanolysin浓度为 1 0mg/L时 ,只需 2 5min其原生质体形成率就达此值。制备的长双歧杆菌原生质体倾入自制的双层再生培养基中 ,在厌氧条件下能很好地回复生长。

2株酵母菌单倍体原生质体形成与再生条件的研究

对酒精高产酿酒酵母GGFS16和GJ2008单倍体原生质体的形成与再生条件进行了研究。结果表明,在菌龄8h、0.2%β-巯基乙醇和0.1%EDTA-Na2预处理20min、1.5%的蜗牛酶37℃处理30min以及使用浓度170g/L的蔗糖作为渗透压稳定剂的条件下,GGFS16和GJ2008单倍体原生质体的形成率和再生率均达到最大。形成率分别是98.14%和97.19%,再生率分别是17.29%和15.78%。

枯草芽孢杆菌Bx-4原生质体形成与再生条件优化

为优化枯草芽孢杆菌Bx-4原生质体形成与再生条件,研究了甘氨酸、青霉素、溶菌酶等因素对原生质体形成与再生的影响。结果表明,在最佳形成与再生条件下,原生质体形成率与再生率分别达到77.44%和88.03%。

无花果曲霉原生质体形成与再生条件的探讨

根据正交试验得出无花果曲霉原生质体形成的最佳条件，用１％的混合酶液（０．５％纤维素酶＋０．２５％蜗牛酶＋０．２５％溶菌酶）作用无花果曲霉菌体细胞，原生质体产量达３．２×１０７个·ｍｌ－１，渗透压稳定剂为０．６ｍｏｌ·Ｌ－１ＫＣｌ于０．２ｍｏｌ·Ｌ－１ＰＯ３＋４（ｐＨ５．８）中，酶解时间和酶解温度分别为３．０ｈ、３０℃．比较不同酶解时间、再生稳定剂和碳源等因素对原生质体再生的影响，可确定最佳再生条件，再生率达３０％以上．

氧化葡萄糖酸杆菌原生质体的形成和再生研究

报道氧化葡萄糖酸杆菌原生质体的形成和再生的方法。将最佳生长条件下对数生长后期的培养物以溶菌酶处理,YE培养基上再生原生质体、原生质体形成率约99%,再生率2.93%。

红曲霉M_(9x)的原生质体形成与再生条件的研究

对红曲霉M9x用混合酶制取原生质体及原生质体再生条件进行了探索。其原生质形成和再生最佳条件为:以豆芽汁培养液为菌丝培养基,采用60h菌龄的菌丝体,以0.6mol/LMgSO4作为渗稳剂,用1.5%混合酶(蜗牛酶:纤维素酶=7:3)在30℃处理2h,原生质体形成数可以达到1.61×107个/ml,再生率为8.49%。