一种高通量提取桃DNA方法的建立与应用

【目的】DNA制备是大规模基因型筛选和分子标记辅助选种的重要前提,本研究采用一种1.2 m L八联排管代替单个离心管,探索一种操作简便、节约时间、成本低的桃DNA快速提取方法,以满足高通量遗传研究的需求,提高工作效率。【方法】以普通生长型桃(standard type,ST)‘中油桃8号’为母本,温度敏感半矮生型桃(temperature-sensitive semi-dwarf in Prunus persica,Pp Tssd)‘09-1-112’为父本,杂交获得F1代分离群体500株实生苗为载体,包括温度敏感半矮生型246株,普通生长型254株,建立一种高通量、低成本桃DNA提取方法。利用1.2 m L八联排管结合八通道移液器,简化提取步骤,提取桃幼嫩叶片中的基因组DNA;通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA浓度、纯度和完整性进行检测。基于高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM),采用96孔板对温度敏感半矮生型桃和普通生长型桃共500个F1分离后代单株进行PCR扩增和基因分型,区分TSSDtssd基因型与tssdtssd基因型。基于双亲表型与基因型一致,开发In Del位点,PCR扩增后,采用SDS-PAGE在F1群体中进行验证,确定利用分离的DNA是否正确区分不同基因型。【结果】分离的DNA经紫外分光光度计检测,浓度范围约为25—200 ng·μL-1,OD260nm/OD280nm约为1.81—1.98,DNA纯度较高;琼脂糖凝胶电泳条带清晰、单一,DNA完整度较高。参考桃基因组(Version 2.0),根据双亲深度测序数据,开发获得SNP标记SNP_Pp03_3758620,应用于高分辨率熔解曲线基因分型,发现温度敏感半矮生型和普通生长型呈现明显不同的峰型,证明提取的DNA模板可应用于HRM基因分型。基于双亲基因型与表型一致,开发In Del标记In Del_Pp03_3829009,聚丙烯酰胺凝胶电泳的验证结果显示PCR扩增具有较高的强度,获得与目的片段大小一致的特异性条带,且在两种不同生长型单株中具有明显的多态性,表明PCR扩增稳定,提取的DNA可用于基于In Del标记的多态性分析。使用该提取方法,每人每天可以完成1 000个样品的DNA提取,成本较低,且不会对幼苗早期生长造成影响。【结论】建立了一种简便、有效、低成本的桃基因组DNA提取方法,可以满足基因分型、品种鉴定及遗传分析等分子生物学研究,实现了大批量不同样本基因组DNA的同时提取,具有较高应用价值。

桃树脂提取物的抗衰老功效研究

皮肤老化由多种因素引起,主要包括年龄导致的自然老化和暴露于环境导致的光老化。大气中的紫外线、雾霾中的多环芳烃均能造成皮肤炎症、细胞活性和功能下降,最终导致皮肤松弛、老化,形成皱纹、斑点。本研究以桃树脂提取物(PG)为研究对象,通过多种方法对其紧致、抗皱的功效进行研究。结果显示,在成纤维细胞衰老模型上,PG在质量分数为0.3%~10%的范围下能剂量依赖性地促进成纤维细胞增殖、Ⅰ型胶原蛋白合成,降低β-半乳糖苷酶的活性。在紫外线(UVA)和雾霾类似物苯并芘(BaP)造成的角质形成细胞衰老模型上,质量分数为0.1%~10%的PG可以抑制细胞因子前列腺素E2和基质金属蛋白酶1表达,恢复细胞活性,并降低β-半乳糖苷酶的活性。在人体临床评价上,质量分数为2%~10%的PG具有显著的即时提升皮肤含水量、降低经皮失水率、提升紧肤感、减少皱纹效果。PG作为一种天然来源的活性原料,可应用于皮肤保湿、紧致、抗皱系列产品中。