柑橘类植物SOD基因片段的克隆和SNP分析

[目的]对柑橘类植物遗传多样性进行精确分析研究。[方法]根据已报道的各种植物Mn/Fe-SOD基因的氨基酸序列上前后2个保守区设计1对简并引物,采用RT-PCR技术,分别从岭南沙田柚、柠檬等6种柑橘类植物中克隆得到长426bp的Mn/Fe-SOD基因片段,并对所得序列进行了SNP分析。[结果]柑橘类植物核苷酸同源性高达97.2%,与其他植物Mn/Fe-SOD基因核苷酸序列的同源性都在77.7%以上;经过氨基酸序列推导,每个基因片段分别编码142个氨基酸,6个基因片段的氨基酸同源性为97.9%,与其他植物Mn/Fe-SOD基因的氨基酸序列同源性在79.0%以上。在Mn/Fe-SOD基因片段中有18个核苷酸位点存在SNPs,导致3个氨基酸位点发生变异,多态性频率为1SNP/23.7bp,核苷酸变异度为4.23%,氨基酸变异度为2.38%。[结论]该研究为丰富构建柑橘类植物基因图谱标记和抗逆性状的遗传标记奠定了基础。

油茶SOD基因片段克隆及序列分析

根据已报道的多种植物Cu/Zn-SOD和Mn/Fe-SOD基因的氨基酸序列的保守区域分别设计简并引物,以油茶(Camellia oleifera)叶片总RNA为模板,通过RT-PCR分别扩增得到一个375bp的Cu/Zn-SOD基因片段和一个429bp的Mn/Fe-SOD基因片段。将片段序列在NCBI网站上进行同源性比对,表明本研究克隆的结果均与多种植物的Cu/Zn-SOD和Mn/Fe-SOD基因存在亲缘关系,因而认为所克隆的基因片段就是油茶SOD基因;并运用DNAStar5.0软件分别进行序列分析,推导的氨基酸序列分别为125个残基和143个残基;具有所有植物SOD基因共有的保守区域;与多种植物Cu/Zn-SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均分别在80%和84%以上,与其他植物的Mn/Fe-SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在84%和86%以上。

东亚砂藓Cu/Zn SOD基因的克隆及序列分析

[目的]对东亚砂藓(Rhacomitrunm japonicum)的Cu/Zn SOD基因进行克隆,并对其序列进行分析。[方法]利用RT-PCR技术获得东亚砂藓Cu/Zn SOD基因的cDNA,同时对该序列进行生物信息学分析。[结果]东亚砂藓Cu/Zn SOD基因cDNA长565 bp,包含一个长为465 bp的ORF,编码154个氨基酸残基,预测的该蛋白的分子量为15.5 kD,理论等电点为5.77,负电荷残基(Asp+Glu)总数为18个,正电荷残基(Arg+Lys)总数为12个,不稳定系数是13.36;其编码的氨基酸序列包含了5个蛋白保守区,均为铜锌超氧化物歧化酶超家族所有;Blastn比对表明东亚砂藓Cu/Zn SOD基因与毛尖紫萼藓、小立碗藓相关基因的同源性高达99%和82%。[结论]该研究为进一步研究紫萼藓科植物的抗旱性及苔藓Cu/Zn-SOD在抗非生物胁迫方面的功能提供了理论依据与基础。

白花丹参Cu/Zn SOD基因的克隆和表达分析

目的:获取白花丹参Cu/Zn SOD基因的全长cDNA序列,并分析其序列特征和不同外源胁迫下的表达特征。方法:利用已有白花丹参cDNA全长文库,随机测序获得SmCu/Zn SOD全长序列。BLAST进行序列比对,Motif Scan软件分析氨基酸序列的功能区段,RT-PCR技术分析基因表达特征。结果:获得ORF为459 bp的SmCu/Zn SOD全长cDNA序列,编码氨基酸152个,氨基酸序列分析发现其具有典型的Cu/Zn SOD PROSITE pattern,RT-PCR分析其在叶片中表达量最高。水分亏缺、盐胁迫、低温和ABA处理均能较强的诱导该基因的表达。结论:本研究首次获得白花丹参Cu/Zn SOD全长基因序列,该基因可能参与对干旱、盐碱和低温等非生物胁迫的抵抗。

“台农甜蜜桃”胚性愈伤组织SOD基因家族的克隆与序列分析

以"台农甜蜜桃"胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR和RACE法,首次从台农甜蜜桃中克隆出较为完整的包括Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD 3类型20条的SOD基因家族的全长序列,各成员核酸长度范围在858~1 234bp之间,共编码4种不同的蛋白。生物学分析学分析表明,SOD家族蛋白均为稳定的跨膜蛋白,均含有SOD典型的保守结构域,且在进化上高度保守,但在磷酸化位点上各蛋白差异较大,且3′UTR及5′UTR均具有多态性,可能通过以丝氨酸为主的磷酸化方式,改变酶活性及蛋白构象来参与对桃生长发育的调控。

副结核分枝杆菌SOD基因的克隆与序列分析

以副结核分枝杆菌C-2染色体DNA为模板,以SOD基因特异性引物进行PCR扩增,获得约620 bp的DNA片段。将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,通过α-互补法筛选和质粒酶切及序列分析鉴定,成功构建出重组质粒pGEM-T-SOD,为进一步研究SOD基因及其表达产物的免疫生化特性奠定基础。

西红柿叶片SOD基因分离克隆和测序的研究

利用多聚酶链式反应技术，以西红柿叶片为材料，快速扩增并克隆了Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍ－ｕｔａｓｅ（简称ＳＯＤ）ｃＤＮＡ，并进行序列分析，该基因全长４６５ｂｐ，共编码１５２个氨基酸，与国外已报道基因具有９８％以上的同源性。

红曲菌Mn-SOD基因克隆、表达及序列分析

为得到产Mn-SOD工程菌及表达产物,通过设计出红曲菌H4000 Mn-SOD简并引物得到目的基因片段,再设计全长引物利用PCR技术扩增红曲霉Mn-SOD基因的全长序列。经EcoRⅠ和HindⅢ酶切后连接至相同酶切的表达载体pET28a,并转化至E.coli BL21进行诱导表达。克隆得到的基因预测编码152个氨基酸,预测相对分子量为17 kDa。同时,将克隆得到的Mn-SOD基因与NCBI数据库进行比对,发现该序列与橙色红曲霉超氧化物歧化酶(SOD)基因相似度达到99%,与炭疽菌、米曲霉、黄曲霉的Mn-SOD基因也有较高的相似度。通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况,目标蛋白相对分子质量约为19 kDa,与预测分子量基本相符。该表达蛋白在pH2.0保温处理1 h,仍具有较高的Mn-SOD酶活。

条斑紫菜锰超氧化物歧化酶基因克隆与序列分析

为研究紫菜抗逆抗病的分子机制,以本实验室建立的条斑紫菜表达序列标签（EST）和全长cDNA富集文库,结合PCR技术,克隆了条斑紫菜编码锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）的cDNA及基因组DNA全长序列,并进行了序列特性相关分析.研究结果表明：该基因cDNA序列全长为958个核苷酸,包含一个完整Mn-SOD基因的ORF,编码224个氨基酸和终止密码子;该基因在基因组中序列长度为1416bp,包含4个外显子和3个内含子,这既不同于高等植物的6个外显子和5个内含子,也不同于人的5个外显子和4个内含子;该基因编码区密码子的平均GC含量为60.9%,第三位密码子的GC含量高达84.9%;序列中包含4个与Mn^2＋的结合位点及一个保守的金属结合结构域,预测分子量为24469.09Da,等电点为5.99;条斑紫菜Mn-SOD与人的相关蛋白具有类似的空间结构,都有6个跨膜α螺旋结构域;由cDNA序列推导的氨基酸序列与莱茵衣藻相似性为57.7%,系统发生分析表明条斑紫菜Mn-SOD与绿藻莱茵衣藻和硅藻海链藻的亲缘关系较近.这是该基因在红藻门中的首次报道.

人GPx1基因的克隆及其序列分析

目的 克隆中国人谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx1)的cDNA。方法 用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR) ,以中国人胎盘组织总RNA为模板 ,扩增中国人谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx1)的cDNA ,进行序列分析。计算机分析其二级结构并比较已发现的人GPx家族的 5种GPx氨基酸序列。结果 从中国人胎盘组织中克隆的GPx1基因 ,与国外文献报道相比 ,只有 1个氨基酸残基发生变异 ,即leu2 2 变为Val2 2 ,该变化不影响GPx1活性中心的结构 ;人GPx的硒结合区及活性中心区域的氨基酸序列是高度保守的。结论 首次克隆了中国人体特异的胞质内GPx1基因 ,为其生物学活性及结构与功能的关系的研究创造了条件。

东方粘虫颗粒体病毒超氧化物歧化酶基因的克隆与分析

为获得东方粘虫颗粒体病毒(Pseudelatia separata granulovirus,PsGV)基因组序列,采用随机克隆方法,建立PsGV的质粒基因文库,并通过对插入片段进行克隆鉴定和序列分析,获得编码超氧化物歧化酶蛋白的基因(PsGV-sod)。该基因阅读框为462bp,共编码153个氨基酸。核苷酸和氨基酸同源性比较结果表明该基因与其他颗粒体病毒同源性较高,通过保守基序分析,认为其为铜锌超氧化物歧化酶。

草海桐铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及序列分析

【目的】铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)在保护细胞和组织免受氧化损伤方面起重要作用。对滨海植物草海桐盐胁迫诱导的Cu/Zn-SOD进行克隆和序列分析,为揭示草海桐适应盐碱环境提供理论依据。【方法】以盐胁迫的草海桐为材料,运用RACE技术克隆草海桐Cu/Zn-SOD,命名为SsCSD,采用生物信息学方法进行序列分析,构建pBinGlyRed-SsCSD重组质粒。【结果】通过RACE技术获得SsCSD基因全长共1148 bp,其最大开放阅读框(ORF)为687 bp,编码228个氨基酸。氨基酸保守结构域分析表明,该序列具有铜锌超氧化物歧化酶保守结构域,属于SOD家族。生物信息学分析表明其定位于叶绿体中,氨基酸序列分析显示其与已知植物叶绿体Cu/Zn-SOD的氨基酸残基高度同源。同时将SsCSD基因与植物表达载体pBinGlyRed进行重组,并成功转入农杆菌GV3101中。【结论】草海桐铜锌超氧化物歧化酶氨基酸序列与同源物种相似度高,在进化上高度保守,对进一步通过转基因验证该酶生物学功能具有重要意义。

吴茱萸Mn/Fe-SOD基因全长cDNA克隆及序列分析

目的克隆吴茱萸Mn/Fe-SOD基因的全长cDNA序列。方法根据已获得的吴茱萸Mn/Fe-SOD基因核心片段序列设计4条特异性引物,采用RACE和巢式PCR方法克隆获得吴茱萸Mn/Fe-SOD基因全长cDNA。结果吴茱萸Mn/Fe-SOD基因全长cDNA序列共1 048 bp,包含一个687 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),共编码228个氨基酸。结论首次从吴茱萸中克隆得到了Mn/Fe-SOD基因的全长cDNA序列,为研究该基因在吴茱萸体内超量表达以提高植物抗逆性研究奠定基础。