山杏种子PsMATE40基因启动子的克隆及驱动表达分析

【目的】转运蛋白PsMATE40在山杏种子苦杏仁苷转运中起到重要作用。克隆PsMATE40基因特异启动子并分析其驱动基因表达活性,为PsMATE40基因及其启动子的应用奠定基础。【方法】依据前期克隆得到的PsMATE40基因,以山杏种子基因组DNA为模板,通过染色体步移克隆得到PsMATE40基因特异启动子全长序列(命名为ProPsMATE40),预测分析其顺式调控元件,采用GUS组织化学染色分析检测启动子活性;利用无缝克隆方法分别构建组成型启动子CaMV35S和特异启动子ProPsMATE40驱动的PsMATE40基因的植物表达载体,开展农杆菌介导的烟草瞬时转化,利用RT-qPCR技术比较分析它们驱动PsMATE40基因的转录表达。【结果】山杏种子PsMATE40基因启动子全长序列为1964 bp,含有2种启动子核心元件(CAAT-box和TATA-box)、多种激素信号(生长素、茉莉酸和水杨酸等)响应元件和胁迫(光、干旱和损伤等)响应元件以及种子发育调控元件等,自身特异启动子ProPsMATE40驱动的PsMATE40基因表达水平明显高于CaMV35S。【结论】山杏种子PsMATE4基因表达可能受植物激素以及生物与非生物胁迫等多种因素的复杂调控,而自身启动子可有效促进PsMATE40基因的转录表达。

山药DoWRKY40基因表达特征分析及互作蛋白筛选

【目的】WRKY作为植物特异型转录因子,参与植物生长发育过程。克隆山药DoWRKY40基因,分析其表达模式,通过酵母双杂交技术筛选与DoWRKY40互作的蛋白,探究WRKY40在山药膨大过程中的调控机制。【方法】以‘大和长芋’山药为材料克隆DoWRKY40基因,并进行生物信息学分析、表达模式分析、亚细胞定位,构建山药块茎不同发育时期酵母文库,筛选与DoWRKY40互作蛋白。【结果】DoWRKY40的开放阅读框长为927 bp。DoWRKY40蛋白属于WRKY家族的第II组,含有一个典型的WRKY转录因子保守结构域,定位于细胞核。与几内亚薯蓣亲缘关系较近。DoWRKY40基因在山药块茎生长发育的120 d表达量最高,且在叶、茎和块茎中均有表达,具有组织特异性。山药cDNA文库的库容量为1.484×10^(8);pGBKT7-WRKY40诱饵载体无自激活活性。酵母双杂交法从山药文库中筛选到4类与DoWRKY40相互作用的蛋白,分别参与植物生长发育、细胞周期调节与细胞扩增、信号转导及环境胁迫应答等。【结论】克隆得到DoWRKY40基因,其响应山药的生长发育过程,筛选到的4类互作蛋白表明其在山药细胞膨大及信号转导中起调控作用。

珍珠粟WD40基因家族鉴定及表达特征分析

珍珠粟是世界范围重要的谷物,拥有极强的光合能力和高生产潜力,较其他作物相比,珍珠粟具有对贫瘠土壤的耐受性,能够适应多种非生物胁迫和多样化的环境条件。PgWD40基因家族在植物抵御生物和非生物胁迫以及调控植物生长发育中扮演着重要角色。本研究利用生物信息学方法全面鉴定和分析了珍珠粟中的PgWD40基因家族及其表达模式。研究结果显示,共鉴定出209个PgWD40基因家族成员,通过对珍珠粟和水稻的系统进化分析将其归为5个亚家族,在同一亚族内的成员中,它们的保守序列和基因结构表现出一定的相似性。此外,通过对启动子顺式作用元件的分析显示, 176个PgWD40基因与植物的生长和发育相关, 208个PgWD40基因成员含有不同激素胁迫响应的顺式作用元件,进一步通过转录组数据分析和qRT-PCR分析显示,PMA3G03393.1、PMA4G00558.1、PMA5G02217.1等基因受到盐、热和干旱胁迫的诱导,表明这些基因可能通过依赖不同激素的信号通路来调控和响应非生物胁迫,可作为进一步研究PgWD40基因家族耐受性功能的候选基因。并且PgWD40基因家族成员在珍珠粟抽穗期的不同时期存在表达差异。通过基因表达热图以及GO和KEGG等分析,发现许多PgWD40基因家族成员参与了植物生长发育和籽粒形成的各个阶段。研究结果为全面解析PgWD40基因结构与生物学功能、耐逆性分子机制以及分子育种提供了理论基础,为今后培育高效抗逆作物新品种提供基因资源。

CD40基因多态性与高血压性心脏病的相关性分析

目的本研究旨在探究CD40两个SNP位点rs4810485和rs1883832的多态性是否与HHD的遗传易感性有关。方法采用PCR-RFLP方法对CD40基因的rs4810485和rs1883832 SNP位点进行基因分型。结果CD40基因rs4810485的GG基因型和G等位基因在高血压性心脏病中显著增高,G等位基因为高血压性心脏病的易感基因。结论GG基因型在HHD中显著增高,G等位基因为HHD的易感基因。

木豆WD 40基因家族鉴定及响应茉莉酸甲酯的表达分析

WD40蛋白参与调控植物生长发育、次生代谢产物合成及胁迫应答等生物学过程。WD40主要作为MYB-bHLH-WD40(MBW)蛋白复合体成员之一,激活花青素合成下游基因转录进而促进花青素的积累。探究WD 40基因家族的功能是解析黄酮类次生代谢产物代谢调控机制的关键环节。本研究基于木豆(Cajanus cajan)基因组鉴定了木豆CcWD40家族成员,并对CcWD 40基因进行生物信息学分析以及对茉莉酸甲酯响应的实验。利用生物信息学在木豆基因组中鉴定出116个CcWD 40基因家族成员,系统全面地评价了候选基因的基因结构、染色体分布、启动子顺式作用元件及系统发育进化历程等特征,并分析了其在茉莉酸甲酯处理下的表达模式。结果表明:WD40蛋白质包含的氨基酸残基数目在296~1709之间,等电点范围为4.33~9.58;116个基因可进行定位的基因有68个,这68个CcWD 40基因不均匀分布于11条染色体上,大多位于3号染色体;系统进化树将木豆CcWD 40家族成员分为18个亚家族,尽管其基因结构间内含子差异较大,但在进化树同一分支中的较为相似;共线性分析显示,在所选3种模式植物中,木豆与大豆亲缘关系最近;木豆CcWD 40基因具有多个响应元件,包括胁迫响应元件、发育响应元件和激素响应元件,如脱落酸响应元件(ABRE)、水杨酸响应元件(TCA-element)、赤霉素响应元件(GARE-Motif)等,可见它们的表达受到复杂的调控网络的控制,可能在非生物胁迫中起到重要作用;基于RNA-seq数据分析木豆CcWD40家族基因应茉莉酸甲酯的表达特征,其中96个CcWD 40基因的表达量会在MeJA处理后首先逐渐降低,只有20个CcWD 40基因的表达量会首先呈现升高趋势,并且同一进化分支的CcWD 40基因相应趋势大体相同。该研究将为进一步探索WD 40基因在调控黄酮类化合物合成和响应非生物胁迫应答中的功能提供重要基因资源和理论基础。

玉米ZmWD40s基因家族分析

本研究旨在系统分析玉米ZmWD40基因家族,揭示其多样性、基因结构、染色体分布及其在玉米生长发育中的潜在功能。通过从Uniprot网站下载拟南芥WD40蛋白序列并在Ensembl Plants数据库中下载玉米蛋白序列进行BLAST分析,鉴定出ZmWD40基因家族成员。使用TBtools进行染色体定位和基因结构分析,利用MEGA 7.0构建系统发育树,并通过NCBI CDD数据库进行蛋白保守结构域分析。共鉴定出83个ZmWD40同源基因,这些基因在蛋白质长度、分子大小和等电点上显示出显著差异。染色体分布分析显示,这些基因在玉米染色体上的分布具有显著特征,部分染色体上基因高度集中。系统发育树分析将ZmWD40基因分为5个分支,每个分支内部基因在结构和功能上具有高度相似性。蛋白质域分析显示,ZmWD40基因家族在功能域上的多样性和复杂性,特定基因在基因结构上表现出独特的外显子和内含子组合。ZmWD40基因家族在玉米基因组中的分布和结构揭示了其多样性和复杂性,表明这些基因在玉米的生长发育和环境适应中可能发挥重要作用。本研究为进一步研究ZmWD40基因家族的功能和调控机制提供了基础信息,并为理解这些基因在植物适应环境变化中的作用提供了新的视角。

毒素蛋白PE40的基因克隆及序列分析

细胞因子－受体介导的靶向杀伤作为导向治疗白血病与肿瘤的第二代新策略，是现代分子导向药物研究的最新领域之一。它是利用细胞因子与其受体的特异性结合来导向传递重组细胞因子－细菌外毒素融合蛋白以达到特异性杀伤高表达相应细胞因子受体的白血病及肿瘤细胞〔１～３〕...

SV40T胃壁细胞定位表达转基因小鼠的建立

目的构建胃壁细胞定位表达SV40T的真核表达载体并制备转基因小鼠动物模型,为研究胃癌发病机制提供动物模型。方法从构建的胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV中酶切回收3.8kb的基因片段H+-K+ATPaseβpromoter/SV40T,通过显微注射的方法制备转基因小鼠,PCR和Southern blotting检测阳性转基因小鼠并建系繁殖,RT-PCR检测基因的表达情况。结果将422枚注射过的受精卵移植给16只假孕雌鼠,共生出77只仔鼠,移植成功率为18.2%。在出生的77只仔鼠中,2#、4#、8#、16#、24#、51#、57#、61#、68#、73#经PCR检测为阳性首建鼠。除68#不育外,其他9个品系首建鼠共生出99只F1代鼠。8#品系23只F1代尚未发现阳性鼠,另8个品系F1代经PCR和Southern blotting检测发现31只阳性鼠,阳性率为40.8%(31/76)。RT-PCR检测F1代阳性鼠均仅在胃组织中有SV40T基因的表达,而在心、肝、肾、肺、食道、肠、骨骼肌等组织中均不表达。不育首建鼠处死解剖发现胃组织有肿瘤存在。结论建立了胃壁细胞定位表达SV40T基因的转基因小鼠动物模型。

HLA-B40组等位基因多态性和血清学分型不明确标本分析

目的 利用DNA分型技术调查上海汉族人群HLA-B40组等位基因多态性并比较配型标本中HLA-B40抗原血清学和DNA分型的结果。方法 采用反向PCR-SSOP技术进行DNA分型,可检出HLA-B＊4001-4011等11个等位基因。结果所有样本DNA分型均获成功,无假阳性和假阴性结果出现。质控DNA分型结果与UCLA结果相符。上海地区汉族人群共检出B＊4001-4003、4005-400、4011等等位基因,未检出B＊4004、4008-4010等等位基因。296名无关个体中HLA-B40＊组等位基因频率为0.140 2。血清学方法检测HLA-B40组抗原错误率为12.82％（10/78）。结论 该技术用于HLA-B40分型分辨率高,分型结果较血清学方法更加精确,可确保HLA分型的准确。

黑果枸杞WD40编码基因LrAN11的克隆及表达分析

WD40蛋白广泛存在于真核生物中,是一类高度保守的蛋白家族,具有广泛的生物化学和细胞生物学功能。为探索黑果枸杞LrAN11的功能,采用同源克隆的方法克隆了黑果枸杞WD40蛋白基因,将其命名为LrAN11,Gen Bank登录号:KY131959。生物信息学分析结果表明,该基因的编码区长1 029bp,编码342个氨基酸,蛋白分子量为38.3 kD,理论等电点为4.95,含有5个WD40基序,属于WD40类蛋白基因家族;经预测LrAN11定位于细胞质中,该基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性,与马铃薯、番茄、甜椒和美花烟草具有较近的亲缘关系;定量RT-PCR检测表明,LrAN11基因在黑果枸杞各组织中均有表达,其中在青果中的相对表达量最高,在根和紫果中次之,而在黑果中表达最低,表明LrAN11可能参与黑果枸杞花青素的生物合成的调控;在韩国枸杞和0901枸杞品种中表达显著,在其他14个枸杞品种中表达均较低且无显著差异性(P>0.05),说明LrAN11的表达具有品种特异性。此外,随着NaCl处理时间的延长,该基因的表达量先降低后升高,且在2、12和24 h的表达量与对照相比存在显著差异性(P<0.05),说明LrAN11可能参与黑果枸杞对盐胁迫的响应。本研究结果为进一步阐明黑果枸杞LrAN11基因的功能及其在黑果枸杞遗传改良中的应用奠定了基础。

牡丹WD40类转录因子基因PsWD40-1和PsWD40-2的分离与序列分析

利用已构建的牡丹‘洛阳红’花瓣转录组数据库,筛选得到2个与植物花青素苷合成WD40蛋白同源性较高的Unigene序列,分别命名为PsWD40-1和PsWD40-2。利用RT-PCR技术,设计特异性引物对PsWD40-1和PsWD40-2最大阅读框(ORF)序列进行扩增,测序结果表明PsWD40-1序列包含一个1 035 bp的ORF,编码一个344 aa的肽链;PsWD40-2序列包含一个1 032 bp的ORF,编码一个343 aa的肽链。牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因推测所编码蛋白序列均具有典型的WD40结构域。PsWD40-1蛋白序列与葡萄VvWDR2相似性为96%,PsWD40-2蛋白序列与葡萄VvWDR1相似性为87%。系统进化树分析发现,PsWD40-1与葡萄VvWDR2、拟南芥AtAN11、陆地棉GhTTG2等序列聚在MP1分支,而PsWD40-2与葡萄VvWDR1、矮牵牛PhAN11、紫苏PfWD40等序列聚在另一分支TTG1/PAC1分支。

一株高度变异的中国SV40分离株的全基因组序列分析

对SV40中国云南分离株YNQD38进行了全基因组核苷酸序列测定。覆盖了整个基因组的9个重叠的基因片段被扩增和测序，与其它SV40株进行了序列比对并基于全基因序列建立了遗传进化树。结果显示：基因组全长5125bp，基因组构成与其它SV40毒株相似，均有6个开放读码框架和1个调控区。YNQD38与已被证实高度保守的其它SV40比，全基因组核苷酸同源性仅为91．0％。在SV40的保守区VP1、VP2、VP3、小t抗原（t—ag）和部分大T抗原（不包括大T抗原C末端）区，YNQD38与其它SV40之间核苷酸同源性分别为90．7％～91．1％、91．7％～92．0％、90．2％～90.8％、92.8％～93．3％、88．5％～89．7％。在SV40的可变区大T抗原C末端（T—ag—C）编码区，YNQD38同源性更低，仅为65．7％～74．3％。YNQD38发生在保守区的核苷酸变异多为无义突变，而发生在变异区的核苷酸变异多为有义突变。YNQD38的调控区缺少一个完整的72bp增强子，这种特别的调控区的结构以前未见报道。基于整个基因组构建的进化树显示该株病毒形成了一个独特的组。以上结果表明YNQD38是目前报道的SV40中变异最大的一株，而且也是第一株被完整测序的SV40中国株。这个报道不仅为SV40中国株的基础研究提供了一个完整清楚的分子生物学资料，还对这样一株高度变异的SV40能否成为人类致病因子进行了初步探讨。

SV40T基因转化的山羊乳腺上皮细胞系及其生物学特性

目的 建立能用于乳腺特异表达基因构件质量检验的山羊乳腺上皮细胞系。方法 根据已发表的SV4 0病毒T基因序列设计引物 ,以整合有SV4 0DNA早期基因区的COS 1细胞基因组DNA为模板 ,用高保真PCR扩增SV4 0T基因。将获得的SV4 0T基因克隆入真核表达载体 ,并用获得的重组表达质粒转染山羊原代乳腺上皮细胞。经有限稀释和反复传代后获得转化细胞克隆 ,对其生物学特性进行研究。结果 扩增出序列正确的SV4 0T基因 ,重组质粒转染获得的转化细胞的对数生长期为接种后第 4天 ,细胞群体倍增时间为 2 3 5h ,克隆形成率为2 6 7%。DNA斑点杂交试验证明转化细胞的基因组中整合有SV4 0T基因 ,染色体核型分析试验表明转化细胞的核型无明显异常 ,裸鼠接种试验证明转化细胞不能形成肿瘤 ,软琼脂集落形成试验表明转化细胞在软琼脂中不能生长。部分细胞克隆已在体外传 30代以上 ,保持正常乳腺上皮细胞的形态特征 ,在胶原基质上能形成腺泡样结构。结论 本研究获得的SV4 0T基因转化的山羊乳腺上皮细胞具有转化细胞系的生物学特性。

CD40-1C/T基因多态性与儿童哮喘的相关性分析

目的研究CD40基因5'非翻译区-1位点C/T多态性在本地区哮喘儿童人群中的分布,探讨其与哮喘发病风险之间的关系。方法以134例哮喘患者作为研究对象,儿童门诊健康体检者113名作为对照组。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测哮喘组和对照组CD40-1C/T位点的基因型及等位基因频率;采用免疫比浊法测定血清总IgE水平。分析该基因多态性与儿童哮喘发病风险及IgE水平之间的关系。结果哮喘组和对照组之间C与T等位基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05);CC基因型与CT+TT基因型之间的分布差异有统计学意义(P<0.05),CC基因型的发病风险是CT+TT基因型的1.75倍[95%可信区间(CI):1.01～3.04]。哮喘组IgE水平在CC与CT、TT基因型间差异有统计学意义(P<0.05)。结论CD40基因5'非翻译区-1位点CC基因型可能与本地区儿童哮喘的发生有关。

转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测

GTS40-3-2是抗草甘膦转基因大豆,为建立GTS40-3-2大豆转化体特异性PCR检测方法,本研究以GTS40-3-2标准品为实验材料,根据已公布转基因大豆GTS40-3-2基因与大豆基因组连接序列信息,利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物,对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测,结果显示,5对特异性引物均能够从GTS40-3-2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp的预期产物,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2转化事件。以转基因大豆GTS40-3-2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测,结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较,最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40-3-2品系特异性检测的最适引物。本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。

鸡40周龄蛋重主基因-多基因混合遗传模型分析

本研究以黑羽绿壳蛋鸡(P1)和白来航鸡(P2)为材料,测定P1、P2及其F1、F2代的40周龄蛋重,应用SEA-G4F2软件分析蛋重遗传规律。结果表明,40周龄蛋重为2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因混合遗传模型(E模型),主基因遗传率为0.4307,多基因遗传率为0.0254,主基因的遗传率远大于多基因的遗传率。

南蛇藤素对ApoE基因敲除小鼠主动脉粥样硬化斑块内CD40配体表达、巨噬细胞和平滑肌细胞数量的影响

目的:探讨南蛇藤素对高脂饲养ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-)主动脉粥样硬化斑块内CD40配体表达、巨噬细胞和平滑肌细胞数量的影响。方法:8周龄雄性ApoE-/-小鼠12只,随机分为南蛇藤素组或二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组,每组各6只。均给以高脂饲养8周,在高脂饲养的后4周,分别给予南蛇藤素2mg·kg-1.d-1或相当剂量的DMSO腹腔注射(ip)4周。麻醉处死小鼠后,取小鼠主动脉,以石蜡包埋,行主动脉根部连续切片.。免疫组化法检测主动脉粥样硬化斑块内CD40配体、CD68和平滑肌α-actin表达水平,以Image Pro Plus 6.0软件进行图像分析。结果:与对照组相比,南蛇藤素组主动脉粥样硬化斑块内CD40配体表达显著减少(P<0.05);巨噬细胞的阳性率显著降低(P<0.05);而两组间动脉粥样硬化斑块内平滑肌细胞的阳性率没有显著差异(P>0.05)。结论:南蛇藤素可能通过减少ApoE-/-小鼠粥样斑块内CD40配体的表达和巨噬细胞的聚集,抑制动脉粥样硬化斑块中炎症反应,而发挥稳定动脉粥样硬化斑块的作用。

鼠CD40配体基因的克隆及表达

目的:克隆和在真核细胞中表达鼠CD40配体(mCD40L)基因,为进一步研究打下基础. 方法:用RT-PCR法扩增mCD40L基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中,重组质粒用脂质体转染H22细胞,G418筛选抗性细胞,用RT-PCR检测目的基因的插入,间接免疫荧光检测目的基因的表达. 结果:含mCD40L,基因重组表达质粒用酶切分析和序列测定进行鉴定后,转染H22细胞经G418筛选获得抗性细胞, 经RT-PCR鉴定有含目的基因,间接免疫荧光鉴定有mCD40L的表达. 结论:成功克隆mCD40

鄂西北地区汉族人群CD40基因单核苷酸多态性分析

目的研究CD40-E1SNP和E4SNP单核苷酸多态性在鄂西北部地区汉族人群中的分布,并探讨CD40基因单核苷酸多态性与血浆可溶性CD40水平的关系。方法 318例汉族人,其中男性187例,女性131例;平均年龄31.2岁。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)及测序的方法,CD40-E1SNP和E4SNP并计算其基因型频率及等位基因频率,酶联免疫吸附分析检测血浆可溶性CD40浓度,并与文献报道不同种族人群比较。结果鄂西北地区汉族人群CD40-E1SNP基因型频率:CC型29.2%,CT型54.1%,TT型16.7%,C、T等位基因频率分别为56.3%、43.7%,这种多态性分布在男女间差异无统计学意义(P>0.05),与英国、波兰比较,发现不同种族间CD40-E1SNP基因型分布及等位基因频率差异均存在统计学意义(P<0.01);CD40-E1SNP各基因表型之间可溶性CD40含量分别为:CC(57.3±6.6)pg/mL,CT(34.2±4.5)pg/mL,TT(28.8±4.2)pg/mL,差异存在统计学意义(P<0.01)。在实验中未检测到CD40-E4SNP单核苷酸多态性。结论鄂西北地区汉族人群中存在CD40-E1SNP单核苷酸多态性,其基因型在不同种族间存在较大的差异,并且可能影响CD40的表达,而不存在CD40-E4SNP单核苷酸多态性。

基因pf40在玉米中的遗传转化

【目的】基因pf40来源于谷子未成熟种子cDNA文库,它或其同源基因普遍存在于禾本科植物中。初步研究显示pf40具有促进分蘖(枝)的功能。本文旨在研究玉米的分蘖特性是否与pf40功能相关。【方法】以玉米自交系Z3、Z31与Q31杂交组合的胚性愈伤组织为转化受体,用基因枪轰击法将pf40超表达载体(PF40HS)和抑制表达载体(PF40R)导入玉米。然后观察pf40超表达和抑制表达两种不同表达类型的转基因玉米分蘖表型。【结果】经潮霉素筛选和PCR检测,共获得53株T0代转基因玉米。通过对T1、T2代转基因玉米的PCR检测以及Southern和tRNA dot blot分析表明,外源pf40已整合到玉米基因组中并得到表达,而且能稳定地遗传给下一代;通过对转pf40玉米茎基部的分蘖表型的观察发现,无论是转超表达载体还是抑制表达载体的转基因植株与未转基因植株均无明显差异。【结论】单独调控玉米中的pf40或其同源基因并不能改变玉米的分蘖表型特征,玉米中的pf40或其同源基因的确切功能,尚待进一步研究。