Detection of the Mex Efflux Pumps in <i>Pseudomonas</i><i>aeruginosa</i>by Using a Combined Resistance-Phenotypic Markers and Multiplex RT-PCR

The aim of this study was to detect the expression of 4 clinically-important efflux pumps in the Resistance-Nodulation-Cell Division (RND) family including MexAB-OprM, MexXY, MexCD-OprJ and MexEF-OprN in Pseudomonas aeruginosa using a combination of resistance-phenotypic markers and multiplex RT-PCR (mRT-PCR). The antibiotic substrates specific for each Mex systems were used as phenotypic markers including carbenicillin, MexAB-OprM, erythromycin, MexCD-OprJ, norfloxacin and imipenem, MexEF-OprN and gentamicin, MexXY-OprM. The methods were validated with reference strains with known genotypes of the Mex systems and the potential applicability in clinical practice was tested with clinical isolates. The results for the reference strains support that the combination of resistance phenotype and mRT-PCR is a potential-attractive method for diagnosis of efflux-mediated resistance in P. aeruginosa. Further development to make it more practical for clinical use and study in a larger number of clinical isolates is required.

铜绿假单胞菌主动外排系统MexAB-OprM与耐药的关系研究

目的 研究铜绿假单胞菌对碳青酶烯类抗生素的耐药机制。方法 以亚胺培南为代表 ,应用逆转录 (RT) PCR方法并设置内参照 ,分别研究临床分离的铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株和亚胺培南敏感株的主动外排系统MexAB OprM中OprM的结构基因OprM的mRNA表达水平。结果 耐药组OprM的mRNA表达水平明显高于敏感组。结论 主动外排系统MexAB OprM的表达水平增高或异常增多与铜绿假单胞菌对以亚胺培南为代表的碳青酶烯类抗生素耐药密切相关。

铜绿假单胞菌MexAB-OprM主动外排表型筛选和外排基因检测

目的研究解放军总医院临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌的主动外排系统,为指导临床合理选择抗生素提供依据。方法采用外排泵抑制剂(苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺)与喹诺酮类抗生素,以微量肉汤稀释法测定加与不加外排泵抑制剂时环丙沙星与左氧氟沙星的最低抑菌浓度(MIC)值,并计算MIC值的变化,根据加与不加外排泵抑制剂MIC值降低3个稀释度及以上筛选主动外排表型阳性菌株;PCR扩增外排表型阳性菌的耐药基因oprM、mexB和mexR,并对3株菌进行mexR基因测序分析;RT-PCR检测oprM基因的mRNA水平,分析耐药基因的表达情况。结果苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺能极大的降低左氧氟沙星和环丙沙星的MIC值,70株多重耐药铜绿假单胞菌中46株表型阳性(65.7%),其中PCR检测oprM、mexB和mexR基因同时阳性菌株42株(91.3%),仅oprM基因阳性2株(4.3%),oprM、mexB和mexR基因均阴性2株(4.3%)。RT-PCR产物测定A值(A260/A280)与PAO1对照阳性菌株13株,以PAO1的oprM/rpoD的A值为对照阳性菌株4株,同时满足A值(A260/A280)和oprM/rpoD比值均高于PAO1的菌株3株。测序结果与GenBank中已知的mexR基因比对,其中2株同源性为100%,1株第434位核苷酸插入2bp(AT)。结论中国人民解放军总医院多重耐药铜绿假单胞菌大多存在主动外排的耐药机制,其耐药与外排泵过度表达相关。

碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌外排泵MexAB-OprM的研究

目的研究铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药与外排泵MexAB-OprM的相关性。方法琼脂稀释法测定亚胺培南和美罗培南对75株铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC),联合外排泵抑制剂MC207110进行外排泵表型的筛选;用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增MexAB-OprM融合蛋白结构基因mexA以及内参基因rpoD,并测定其mRNA的表达量,用PCR扩增MexAB-OprM相对高表达菌株的外排泵调节基因mexR、nalC和nalD,对扩增产物进行DNA双向测序;结果进行BLAST比对分析。结果 75株铜绿假单胞菌中外排泵表型阳性菌株13株,其中10株细菌的MexAB-OprM相对表达量增高,此高表达MexAB-OprM菌株的调节基因mexR、nalC及nalD均阳性。其中9株菌nalC均发生第71位氨基酸突变(甘氨酸→谷氨酸)、8株菌同时还有第209位氨基酸突变(丝氨酸→精氨酸),仅发现1株菌nalD第158位氨基酸突变(苏氨酸→异亮氨酸),8株菌mexR发生突变。结论外排泵MexAB-OprM的高表达在铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药中可能起到重要作用。MexAB-OprM的高表达与其调节基因突变相关。

铜绿假单胞菌主动外排系统MexAB-OprM的研究进展

医院感染在感染性疾病中占有相当比例。院内感染的病原菌中,铜绿假单胞菌的感染高居榜首,且耐药状况十分严重。主动外排系统是细菌存在耐药性并发生获得性多重耐药的主要原因。M exAB-OprM型外排系统因具有广谱的外排活性成为铜绿假单胞菌最具临床意义的药物外排系统。本文对细菌主动外排系统的分类,PA M exAB-OprM外排系统的组成、结构、重要作用及表达调控予以综述,并对其治疗研究作出展望。

MexAB-OprM主动外排系统在全耐药铜绿假单胞菌耐药中的作用及机制

目的探讨MexAB-OprM主动外排系统(外排泵)在全耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用及其过度表达的机制。方法联合L-酚丙氨基-L-氨基酰-β-萘胺(MC-207,110)和环丙沙星(CIP),测定26株全耐药铜绿假单胞菌的MIC;用RT-PCR法扩增MexAB-OprM内膜转运蛋白MexB的结构基因mexB和内参照基因16SrDNA片段,根据mexB与16SrDNA扩增产物的电泳扫描比值,分析mexBmRNA的表达水平,判断MexAB-OprM的表达情况;用PCR法扩增MexAB-OprM调控基因mexR并对其产物测序,用Blast软件在GenBank中与已知序列比对。结果联合MC-207,110后有20株(76.9%)CIP的MIC值下降4倍及以上;26株全耐药铜绿假单胞菌中有22株MexAB-OprM高表达,其中有15株mexR基因发生变异,13株发生点突变,出现氨基酸替换,2株发生插入突变,导致氨基酸插入;点突变位点是336G-A、603G-A、660G-A、584C-G、653T-A,后两者导致氨基酸替换103Ala-Gly、126Val-Glu,插入突变是在470和474核苷酸间插入碱基GGC,导致66和68氨基酸间插入Ala。结论MexAB-OprM主动外排系统的高表达对铜绿假单胞菌的耐药性起重要作用,调控基因mexR的突变是其高表达的原因之一。

奥美拉唑对耐氧氟沙星的铜绿假单胞菌主动外排泵的抑制作用

目的研究奥美拉唑作为主动外排泵抑制剂提高铜绿假单胞菌对氧氟沙星的敏感性。方法二倍稀释法筛选临床分离的铜绿假单胞菌,测定耐氧氟沙星菌株对主动外排泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)和加入奥美拉唑后的敏感性。将CCCP和奥美拉唑分别加入铜绿假单胞菌培养液,分为单纯培养的铜绿假单胞菌组、铜绿假单胞菌+CCCP组、铜绿假单胞菌+奥美拉唑组,用RP-HPLC测定分别加入CCCP和奥美拉唑后的0.17、0.50、0.75、1、3、8、15、30、60 min时铜绿假单胞菌菌体内摄取氧氟沙星的含量。结果在不同时间点,铜绿假单胞菌+CCCP组和铜绿假单胞菌+奥美拉唑组菌体内摄取的药量均显著高于铜绿假单胞菌组。结论奥美拉唑作为主动外排泵抑制剂,可增强铜绿假单胞菌对氧氟沙星的敏感性。

铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗生素耐药性主决定因素的研究

对 β-内酰胺类抗生素耐药的铜绿假单胞菌临床分离株的耐药机理进行了研究 ,内容包括 β-内酰胺酶的表达、细胞外膜通透性、主动外排和青霉素结合蛋白的改变等 ,重点研究了 2株对头孢他啶耐药且其MIC相似的临床分离铜绿假单胞菌 P.a.18SH和 P.a.143811。在这 2株菌中没有发现主动外排现象引起的细菌对 β-内酰胺类抗生素耐药 ,其中 ,P.a.18SH对头孢他啶的耐药性可由其低的细胞外膜通透性和高活性Class C类 β-内酰胺酶的表达来解释。P.a.143811有相当高的外膜通透性 ,其产生的 β-内酰胺酶特点与 P.a.18SH相似 ,但表达水平及总活性比 P.a.18SH酶低 ,与敏感菌相似。通过进一步的研究发现 ,P.a.143811的耐药性可能由于其具有多个 PBP基因突变 ,导致多个 PBPs对 β-内酰胺抗生素的敏感性发生改变或过度表达 ,其中的几个低分子量 PBPs可能与 D,D-羧肽酶活性有关。这是第一次在耐药的铜绿假单胞菌临床分离菌中报道 PBPs的过度表达。提示铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性具有多样性 ,在新药研制和临床使用抗菌药物时应注意这些耐药特点。

左氧氟沙星和美洛培南体外诱导铜绿假单胞菌耐药的外排机制研究

目的:研究左氧氟沙星和美洛培南对铜绿假单胞菌耐药的诱导作用及诱导耐药的外排机制。方法:多步诱导法对3株铜绿假单胞菌进行诱导耐药试验,对诱导出的菌株用微量肉汤稀释法测定加与不加外排泵抑制剂(苯丙氨酸-精氨酸-!萘酰胺)的最小抑菌浓度(MIC)的变化,PCR法检测外排泵基因oprM和mexB,并扩增mexR基因进行DNA测序。结果:3株菌均诱导出稳定的耐左氧氟沙星和美洛培南的耐药株,MIC值与原菌比较分别增加了16倍～64倍和2倍～16倍,加外排泵抑制剂后左氧氟沙星的MIC值降低了4倍～8倍;3株菌诱导前后均扩增出外排泵基因oprM和mexB,mexR测序结果与GenBankU23763比较,核苷酸序列第222位(C→T),氨基酸序列(CTG→TTG)均为LEU,为无义突变,核苷酸序列第436位插入1bp(A)移码框。结论:左氧氟沙星和美洛培南可诱导铜绿假单胞菌产生获得性耐药,其耐药机制与主动外排相关。

铜绿假单胞菌主动外排系统研究进展

主动外排系统在铜绿假单胞菌耐药形成过程中起到重要作用,近年来对其的研究也愈来愈多。截止到目前为止,在铜绿假单胞菌中总共发现了13种外排泵,其中12种属于耐药节结细胞分化(resistance nodulation cell division,RND)家族的外排泵,另外1种属于多药和毒物化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family,MATE)。本文就铜绿假单胞菌13种外排泵的底物谱、调控机制以及相关的基础研究进展进行综述。

主动外排泵对铜绿假单胞菌摄入硅纳米颗粒的影响研究

目的探讨主动外排泵对铜绿假单胞菌(PA)摄入硅纳米颗粒的影响,为将其作为药物载体提供实验依据。方法收集中南大学湘雅二医院2007年1—6月检测的PA临床菌株24株,分别编号为S1～S24;以PA的野生菌株PA01作为MexA基因的阳性对照。将筛选出的6株PA临床菌株及野生菌株PA01培养到对数增长期,分别以终浓度为30μg/ml(高浓度组)和终浓度为6μg/ml(低浓度组)的硅纳米颗粒加入到菌液中,培养2、4、8、12、24 h时取样并在电子显微镜下观察硅纳米颗粒摄入情况。结果 24株PA临床菌株菌液中均有不同程度的外排泵基因表达,S24同时表达4种外排泵基因(MexA、MexC、MexX、MexE)。PA01(仅表达1种外排泵基因MexA)与S24摄入的硅纳米颗粒情况相似,PA01菌液培养2 h时可以发现硅纳米颗粒摄入,以12、24 h时硅纳米颗粒摄入最多,且摄入情况相似;高浓度组S24培养24 h时硅纳米颗粒摄入量是低浓度组的2倍。结论硅纳米颗粒不完全受主动外排泵的影响,至少有一部分硅纳米颗粒能进入到细菌体内并持续一段时间,这为其作为抗菌药物载体提供了实验依据。

铜绿假单胞菌耐药机制及中医药治疗研究进展

随着抗生素的不规范使用,近年细菌耐药率越来越高。临床尤以感染性疾病的多见病原菌——铜绿假单胞菌最为突出,不仅是临床急危重症的棘手问题,也是国际医学界的难题和焦点。为此,作者综述了近5年来铜绿假单胞菌耐药机制研究进展,并对β-内酰胺酶、主动外排系统、密度感应系统等主要耐药机制着力阐述,进而阐释相关的中医药治疗措施,以期为抗生素治疗无果时探索中医药治疗思路提供依据。

铜绿假单胞菌主动外排系统与耐药性关系的研究

铜绿假单胞菌是一种重要的院内感染条件致病菌,常感染癌症患者、烧伤患者等机体免疫力低下的患者,它对多种不同理化性质的药物高度耐药,其主动外排系统在耐药性中起主要作用.主要研究了铜绿假单胞菌主动外排泵的类型、组成及对抗生素耐药性的影响.

某院4株携带Ⅰ类整合酶基因的铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制研究

目的分析该院4株不同耐药程度的Ⅰ类整合酶基因(IntⅠ)阳性铜绿假单胞菌(PA)的相关耐药机制,从而进一步研究不同耐药机制之间的相互作用。方法采用qPCR检测头孢他啶(CAZ)、亚胺培南(IMP)诱导下的4株PA的IntⅠmRNA的相对表达水平;采用PCR检测4株PA的β-内酰胺酶(blaTEM、blaNDM-1、blaVIM、blaIMP)、主动外排系统(MexAB-OprM)、外膜蛋白(OprD2)的表达水平,并采用qPCR检测4株PA的OprM、OprD2的表达水平;采用1%结晶紫染色检测4株PA的生物膜形成能力。结果编号为PA01、PA02、PA04的菌株在CAZ、IMP诱导下,IntⅠmRNA的相对表达水平均较对照组高(P<0.05),PA01、PA02的IntⅠmRNA的相对表达水平高于PA04,组间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05),并且在一定浓度范围内,IntⅠmRNA的相对表达水平随着抗菌药物的浓度增加而增加。但PA03菌株的IntⅠmRNA的相对表达水平较PA01、PA02、PA04低,组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。PA01、PA02检测到blaTEM,而blaNDM-1、blaVIM和blaIMP均未被检测到;PA01、PA02的外排泵相对表达水平高于PA03、PA04(P<0.05);PA01、PA02的OprD2 mRNA的相对表达水平低于PA03、PA04(P<0.05);PA01、PA02的生物膜形成能力弱于PA03、PA04,且PA03菌株的生物膜形成能力最强。结论PA01、PA02、PA04的IntⅠ在抗菌药物的选择性压力下表达增强,并且PA01、PA02对碳青霉烯类耐药主要由IntⅠ高表达、外排泵过表达及膜通透性降低介导,与β-内酰胺酶及生物膜形成关系不大。

黄芩苷对氟喹诺酮类抗铜绿假单胞菌协同作用的初步报告

目的:研究黄芩苷对氟喹诺酮类药物抗铜绿假单胞菌的协同作用。方法:以二倍稀释法测定药物的体外抗菌活性,筛选耐药菌,然后测定黄芩苷对4种氟喹诺酮类药物(诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星)抗铜绿假单胞菌的协同作用;以CCCP筛选存在主动外排系统的耐药菌,测定黄芩苷对4种氟喹诺酮类药物抗该类耐药菌的协同作用。结果:临床分离铜绿假单胞菌耐药现象普遍,黄芩苷联合4种氟喹诺酮类药物对耐药铜绿假单胞菌有协同抗菌作用,MIC值下降1-2倍。同时存在主动外排系统的耐药菌也表现出抗菌增敏作用。结论:黄芩苷与氟喹诺酮类药物联合应用对耐药铜绿假单胞菌有协同抗菌,对存在主动外排系统的耐药菌也表现出抗菌增敏作用。

鸟氨酸拟肽类外排泵抑制剂合成及增效抗生素对抗铜绿假单胞菌活性研究

为解决铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)对多类抗生素耐药难题,寻找P.aeruginosa外排泵抑制剂是一条有效途径。本研究以二肽类外排泵抑制剂PAβN为先导物,通过改变天然氨基酸侧链结构,设计合成15个全新的鸟氨酸拟肽类衍生物,评价了其协同单环β-内酰胺类抗生素氨曲南对抗P.aeruginosa活性。其中,化合物12b不仅可增强β-内酰胺类抗生素,包括氨曲南、头孢他啶、美罗培南的抗菌活性,还可显著增强大环内酯类抗生素克拉霉素的抗菌作用,显示出广谱的协同增敏作用。此外,化合物12b还具有良好的安全性。初步机制显示,12b直接靶向外排转运体MexB发挥作用。研究结果为发展一类新型的对抗MDR P.aeruginosa的外排泵抑制剂提供了新先导化合物。

多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统的耐药作用

目的探讨MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统(外排泵)在多重耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用。方法选取25株外科监护室分离的多重耐药铜绿假单胞菌,用实时定量RT- PCR测定结构基因mexA、mexX的mRNA表达水平来判断MexAB-OprM、MexXY-OprM外排泵表达情况；用PCR分别扩增其调控基因mexR、mexZ,并对其产物测序,用Blast软件在GenBank与已知序列比较,研究其过度表达的机理。结果25株多重耐药铜绿假单胞菌中,14株高表达MexAB-OprM系统(56％),3株高表达MexXY-OprM系统(12％),这3株菌同时高表达2种外排泵。在8株mexA高表达的菌株中,5株菌发生mexR基因突变,出现氨基酸替代,1株mexR提前出现终止密码子,2株菌未发现mexR基因突变。2株mexX高表达的菌株均发生基因mexZ突变,出现氨基酸替代。结论主动外排系统MexAB-OprM、MexXY-OprM在多重耐药铜绿假单胞菌中过度表达,是此菌多重耐药机制之一；外排泵MexAB-OprM、MexXY-OprM高表达分别与调控基因mexR、mexZ发生变异有关,同时存在其他调控机制。

铜绿假单胞菌主动外排系统MexAB-OprM与碳青霉烯类药物耐药的关系研究

目的:探讨临床分离的铜绿假单胞菌的主动外排系统MexAB-OprM与其对碳青霉烯类药物耐药之间的关系,研究其耐药分子机理。方法:测定临床分离的铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南的体外抗菌活性,根据耐药情况,分为碳青霉烯类药物敏感组和碳青霉烯类药物耐药组;应用RT-PCR方法,研究两组菌株的主动外排系统MexAB-OprM中结构基因oprM的mRNA表达水平;用PCR法扩增两组菌株的泵调节基因mexR,对扩增产物进行DNA双向测序。结果:耐药组oprM的mRNA表达水平明显高于敏感组(P<0.05);一株菌发现MexR第126位氨基酸突变(缬氨酸→谷氨酸),两株菌发现MexR第70位氨基酸突变(精氨酸→谷氨酰胺)。结论:山西医科大学第一医院临床分离铜绿假单胞菌的主动外排系统MexAB-OprM参与碳青霉烯类药物的耐药;MexAB-OprM高表达的分子机理可能与泵调节基因mexR的突变以及其他突变型有关。

外排泵高表达和外膜蛋白缺失在铜绿假单胞菌对碳青霉烯耐药中的作用

目的探讨铜绿假单胞菌(PA)外科监护室(SICU)分离株对碳青霉烯的耐药机制。方法用W estern印迹和逆转录PCR测定外膜蛋白OprD、OprN表达水平和基因m exA的mRNA水平;用PCR扩增IMP、VIM金属酶基因和主动外排系统M exAB-OprM调控基因m exR,并测序。结果从SICU分离的49株PA,42株对碳青霉烯耐药,其OprD表达除PA42外均有不同程度的降低或缺失,而正常表达OprD的7株菌,均对2种碳青霉烯敏感。27株菌高表达主动外排系统M exAB-OprM,高表达组对亚胺培南耐药率81.5%(22/27)与低表达组耐药率86.4%(19/22)比较差异无统计学意义(χ2=0.005,P=0.943);而高表达组对美罗培南耐药率44.4%(12/27)与低表达组耐药率13.6%(3/22)比较差异有统计学意义(χ2=5.417,P=0.020)。14株表达了M exEF-OprN,但表达组对亚胺培南和美罗培南耐药率与未表达组耐药率比较差异均无统计学意义(χ2=0.000,P=1.000)。8株高表达M exAB-OprM主动外排系统的调控基因m exR发生变异,其中7株出现氨基酸替换,1株提前出现终止密码子。未发现产IMP、VIM金属酶菌株。结论本院SICU分离的PA,对碳青霉烯耐药主要是由外膜蛋白OprD表达降低或缺失引起,与IMP、VIM金属酶无关;主动外排系统M exAB-OprM的高表达对美罗培南的耐药起重要作用;其高表达与调控基因m exR变异有关。

主动外排泵在铜绿假单胞菌多药耐药机制中的作用实验研究

目的采用荧光定量RT-PCR的方法检测铜绿假单胞菌MexAB-Opr M、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-Opr M、MexGHI-OpmD 5种外排泵表达情况,探讨主动外排泵在多药耐药铜绿假单胞菌(MDRPA)耐药机制中的作用。方法采用分子克隆技术,构建克隆载体pMD18-T-mexB、pMD18-T-mexD、pMD18-T-mexF、pMD18-T-mexF、pMD18-T-mexY及pMD18-T-rpsL作为定量模板,建立标准曲线;采用荧光定量RT-PCR检测并分析30株MDRPA临床分离株外排基因mexB、mexD、mexF、mexH、mexY的mRNA表达。结果成功构建pMD18-T-mexB、pMD18-T-mexD、pMD18-T-mexF、pMD18-T-mexF、pMD18-T-mexY及pMD18-T-rpsL的标准曲线;在30株MDRPA中,16株高表达MexAB-Opr M(53.33%),7株高表达MexCD-OprJ(23.33%),8株高表达MexEF-OprN(26.67%),2株高表达MexGHI-OpmD(6.67%),3株高表达MexXY-Opr M(10.00%)。结论主动外排泵在多药耐药铜绿假单胞菌耐药机制中起着重要作用。