铜绿假单胞菌VgrG1a蛋白的原核表达及其人鼠嵌合型单抗的制备与鉴定

目的探究铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统缬氨酸甘氨酸重复蛋白G1a(VgrG1a)的原核表达方法,并制备其鼠源性和人鼠嵌合型单克隆抗体,为抗铜绿假单胞菌感染的诊断和治疗提供基础。方法根据NCBI网站上查找到的VgrG1a序列构建重组质粒pET-21a-VgrG1a,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)plysS进行诱导。通过免疫沉淀法和酶联免疫吸附实验(ELISA)对诱导得到的重组蛋白进行表达、纯化和鉴定。用纯化后的VgrG1a重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠源多克隆抗体,并利用ELISA方法测定小鼠血清抗体的效价和特异性。通过P3X63Ag8.653骨髓瘤细胞融合小鼠脾细胞制备杂交瘤细胞,再通过有限稀释法获得单克隆细胞。经多次ELISA筛选出能够稳定表达特异性抗体的细胞株。测序后获得单克隆抗体的序列信息,并构建人鼠嵌合基因,设计出含有此嵌合基因抗体的质粒,转染Expi293细胞,制备人源化单克隆抗体。结果实验成功构建了VgrG1a重组质粒,经探索在最佳表达诱导条件下[16℃下使用0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导16 h],表达得到了重组蛋白VgrG1a。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,相对分子质量72000处重组蛋白浓度最高。检测制备的鼠源抗体在稀释到1/640000后效价仍较高,并且与目的蛋白能特异性地识别并结合。人鼠嵌合型单克隆抗体8A4F5对抗原VgrG1a亲和力高于鼠源单克隆抗体。结论该原核表达的重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的重组蛋白制备的单克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究蛋白的结构与功能、研制相关的诊断试剂及疫苗提供了生物材料。

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF原核表达载体的构建及表达

目的克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF基因,构建原核表达载体并鉴定表达。方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,PCR扩增OprF羧基端,克隆至原核表达载体pET28b中,构建重组表达载体pET28b-F。重组质粒经酶切和序列测定后,转化E.coliBL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,进行SDS-PAGE检测。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后OprF蛋白免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤方法制备相应单克隆抗体并用ELISA方法进行鉴定。结果 pET28b-F原核表达载体构建成功。重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprF。获得4株高分泌型特异性单克隆细胞株,其中2株单克隆抗体可用于制备双抗体夹心法ELISA试剂盒,检测铜绿假单胞菌。结论成功克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF羧基端基因片段并在大肠杆菌中进行表达,筛选出特异性抗OprF单克隆抗体。

铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析试纸的制备

目的 研制快速、准确检测铜绿假单胞菌(P.aeruginosa,Pa)的胶体金免疫层析试纸。方法 采用生物信息学对铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF进行分析后,化学合成抗原决定簇丰富、种内同源性高的基因序列,连接至pET-28a(+)载体,构建表达载体pET-28a-OprF,转入E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经Ni SepharoseTM6 Fast Flow纯化。将纯化的重组OprF蛋白免疫2只雌性BALB/c小鼠,共免疫3~4次,首次免疫为背部皮下多点注射,后续免疫为腹腔注射。通过动物细胞融合技术筛选单克隆抗体,利用单克隆抗体、双抗夹心免疫层析技术制备铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析试纸,并评价其特异性、灵敏度及稳定性。结果 获得2株可配对的单克隆抗体Pa-1#和Pa-2#,抗体效价均达到1∶409 600,均可特异性识别OprF。制备的胶体金免疫层析试纸检测灵敏度为1.0×106CFU/mL,与9种常见的呼吸道病原菌无交叉反应,且稳定性较好。结论 制备的胶体金免疫层析试纸可在15 min内快速检测铜绿假单胞菌,特异性强,且具有良好的稳定性。