微孔板杂交法测定椰毒假单胞酵米面亚种的DNA-DNA同源性

采用一种新的DNA DNA杂交方法—微孔板法对椰毒假单胞菌酵米面亚种及伯克霍尔德氏菌属中 1 1个种的DNA DNA同源性进行测定。结果发现椰毒假单胞菌酵米面亚种与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及椰毒伯克霍尔德氏菌的DNA DNA同源性均大于 75% ,建议这 3个种应合并为同一个种 ,命名为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 (Burkholderiagladioli)。

用rDNA指纹图分析我国部分椰酵假单胞菌的分子流行病学特征

椰酵假单胞菌的染色体ＤＮＡ经ＢｇｌⅡ＋ＥｃｏＲＶ同时消化后分离，用生物素标记的１６Ｓ＋２３ＳｒＤＮＡ探针杂交，制备其ｒＤＮＡ指纹图。用ｒＤＮＡ指纹图分析方法将５１株椰酵假单胞菌分为２０个核糖型，其中ＲＴ６、９、２包含了一半以上菌株（占５２．９％）。一个省（市）常同时存在２个或２个以上的核糖型，其亲缘关系有近有远；尽管有的核糖型在不同省（市）交叉分布，但各核糖型都分别局限于部分区域。在贵州、江苏、河北３个省的４起食物中毒样品中分离到同一核糖型（ＲＴ６）的菌株，说明这４起食物中毒事件的发生有密切的联系，它们可能由同一克隆的菌株所引起。借助于核糖型分类和聚类分析结果，推断不同菌株间的亲缘关系，为追踪椰酵假单胞菌的传播途径、探讨其进化关系和流行规律提供了一种有效的手段。

糖对椰酵假单胞菌产毒性能的影响研究

以半固体ＬＡ和营养琼脂为基础培养基，分别加入葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘油等４种成分，研究糖分对椰酵假单胞菌产毒性能影响。结果表明，椰酵假单胞菌在营养琼脂和ＬＡ半固体基础培养基上基本不产毒或产毒量很低，而葡萄糖和甘油的加入使椰酵假单胞菌的产毒能力大幅度提高，产毒量不低于在马铃薯葡萄糖琼脂（ＰＤＡ）中，提示了糖代谢在椰酵假单胞菌生长和产毒过程中的重要作用。建议将ＬＤＡ（含葡萄糖的ＬＡ，新设计）半固体做为一种新的椰酵假单胞菌产毒培养基。

云南省椰毒假单胞菌酵米面亚种污染分析及PFGE分型

目的 椰毒假单胞菌酵米面亚种的分布和传播情况。方法 对59份样品进行细菌分离与鉴定,用限制性内切酶SpeI酶切17株椰酵假单胞菌染色体DNA以进行脉冲电泳(PFGE)分析。结果 采集样品59份,分离鉴定出椰酵假单胞菌14株,检出率为23.73%,17株菌的PFGE图谱的相似性系数在53.6%~100%之间,经聚类分析得到14个PFGE型别。结论 云南省部分地区椰酵假单胞菌污染严重,存在食品安全隐患,应进一步从食品源头加强卫生监测;PFGE带型呈多样性,对今后云南省椰毒假单胞菌酵米面亚种引起食物中毒的诊断和溯源有重要意义。

ELISA检测椰酵假单胞菌菌体抗原的研究

椰毒假单胞菌酵米面亚种,已知有0—Ⅲ、0—Ⅳ和0—Ⅴ等菌体抗原型。常规血清试管凝集法检测分型耗时费力。本文在制备不同血清型菌体抗原的抗体和辣根过氧化物酶抗体结合物的基础上,建立了检测椰酵假单胞菌的间接非竞争法、直接非竞争法和双抗体夹心ELISA法,具有快速、简便和较好的特异性。

部分椰酵假单胞菌的产毒力与核糖型分布间的关系

用ｒＤＮＡ指纹图对４２株椰酵假单胞菌进行核糖型分类，探讨该菌的产毒力与核糖型分布之间的关系。结果表明，７３．８％的菌株具有产毒力，它们分布在大多数核糖型中，来源于食物中毒样品及正常食物样品。而产毒力阴性菌株只占２６．２％，它们集中于少数核糖型中，而且都来源于正常食物样品。多个克隆产毒力阳性菌株的广泛存在，提示对该菌的潜在性危害应引起足够的重视。

椰毒假单胞菌酵米面亚种鸟嘌呤和胞嘧啶含量的测定及2种测定方法的比较

利用复性速率法 (Tm值法 )和高效液相色谱法 (HPL C法 )对生化性状比较相近的椰毒假单胞菌酵米面亚种、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌和椰毒伯克霍尔德氏菌共 7个菌株的鸟嘌呤 (G)和胞嘧啶 (C)摩尔百分含量 (G+ C) %进行了测定 ,并对这 2种方法做了对比研究。结果发现 ,3个种的 7个菌株的 (G+ C) %比较接近 ,不能否定这 3个种的细菌属于同一个种。另外 ,HPL C法比 Tm值法的准确性好 。

用单克隆抗体验证椰毒假单胞菌酵米面亚种O抗原型的初步研究

用椰毒假单胞菌种特异性Ｏ－Ⅰ因子及型特异性Ｏ－Ⅳ因子的单克隆抗体Ｐｃｏ６５和Ｐｃｏ１３对从中毒银耳、正常玉米面及动物饲料中新分离的９３株椰毒假单胞菌的菌体抗原型进行了验证。ＥＬＩＳＡ判定结果表明，除１株经再次生化验证鉴定为非椰毒假单胞菌呈阴性反应外，９２株菌均含有种特异性Ｏ－Ⅰ因子，阳性符合率为１００％，其中，４７株菌含有Ｏ－Ⅳ型特异因子，占总菌数的５１．０９％，比血清学分型率（４０．２３％）高出１０．８７％。研究结果表明，鉴定椰毒假单胞菌Ｏ抗原型时、联合应用种间和型间特异性单克隆抗体进行ＥＬＩＳＡ检测，可同时定种分型，方法灵敏、快速，重复性良好。

椰毒假单胞菌酵米面亚种寄生菌的研究

1989年,作者从北京永定河河水、陶然亭湖水中分离到能裂解大肠杆菌的噬菌蛭弧菌。再以椰毒假单胞菌酵米面亚种(简称,椰酵菌)为宿主菌,在双层琼脂平板上培养,4～6天后形成无菌落生长的噬斑。在电镜下观察,证明噬菌蛭弧菌有裂解椰酵菌的能力,同时观察到一种新的瓜子形细菌也有侵袭椰酵菌的能力,值得进一步研究探讨。

椰毒假单胞菌及其酵米面亚种诱变性的研究

选取十二烷基磺酸钠或溴化乙锭(EB)为诱变剂,采用高温连续传代培养法处理椰毒假单胞菌株(NCIB 9450)和部分典型的强产毒椰毒假单胞菌酵米面亚种菌株(Co7、Co5、Co14和HN892y 等),筛选出4株失去产毒能力的菌株:Co14S,Co5S,Co7S 和 P.coS。处理后的菌株一般生物学性状没有改变。

食品中椰毒假单胞菌的污染原因及其检测方法

近年来,有关食品被椰毒假单胞菌引发的公共卫生事件逐渐增多,由于椰毒假单胞菌在食品中分布广泛,发病率和病死率高,目前还缺乏特效的解毒措施,因而引发了人们的广泛关注。本文概括了几种常见食品中椰毒假单胞菌的污染情况并分析污染原因,综述了目前椰毒假单胞菌的检测方法,为生产实践、食品中毒事件溯源提供技术参考。

椰毒假单胞菌酵米面亚种及毒素的污染调查与湿米粉生产风险控制

本文研究了木耳、大米、淀粉及米面制品中椰毒假单胞菌酵米面亚种及其毒素的污染情况,并找出湿米粉生产风险控制的关键点。以生产企业、超市、农贸市场、餐饮单位为采样点,随机抽取生产环节132份样品,包括原料25份、成品11份和环境样品96份;流通环节食品样品144份,按照GB 4789.29—2020唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)进行检验,并结合VITEK2和MALDI TOF MS进行菌种鉴定和建立进化树;采用本实验室建立的液质方法同时检测食品样品中的米酵菌酸和毒黄素。研究结果表明,生产环节原料、成品和流通环节的食品样品共180份均未检出米酵菌酸和毒黄素,分离出唐菖蒲伯克霍尔德菌25株,主要来自于木耳和大米;生产环节中的96份环境样本中未检出唐菖蒲伯克霍尔德菌;分离菌株有四种产毒类型,分别为只产米酵菌酸、只产毒黄素、两种毒素均产和两种毒素均不产;其中6株为椰毒假单胞菌酵米面亚种,检出率为3%(6/276);两种毒素的产量与菌株的培养温度呈正相关,在培养温度为30℃时达到最高值;利用MALDI TOF MS图谱对分离菌株进行K类聚类分析,发现同一产地的大米有很高的亲缘性,可通过此方法对菌株进行溯源。说明木耳及大米较易受到椰毒假单胞菌酵米面亚种的污染,湿米粉生产过程中,企业应将原料间原料和其他生产车间进行有效分隔,防止成品受到原料粉尘或包装袋上微生物的二次污染;在流通环节中,采取低温的保存方式,可减少毒素的产生,最大限度降低或消除风险隐患。

2018年广东省米面制品、淀粉及其制品中椰毒假单胞菌酵米面亚种的调查分析

目的调查分析2018年广东省米面制品、淀粉及其制品中椰毒假单胞菌酵米面亚种。方法在广东省中选取粉丝粉条、河粉米粉等米面制品、淀粉及其制品的企业、超市、农贸市场及餐饮单位为采样点,随机抽取1570份样品按照GB/T 4789.29-2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》进行检验和VITEK2鉴定。结果 1570份样品中5份检出唐菖蒲伯克霍尔德菌,其中只有1份检出椰毒假单胞菌酵米面亚种,检出率为0.06%(1/1570)。结论米面制品、淀粉及其制品中检出唐菖蒲伯克霍尔德菌,表明广东省米面制品、淀粉及其制品中存在被椰毒假单胞菌酵米面亚种污染风险。为最大限度降低或消除风险隐患,相关部门应加强安全监管,保障人民群众身体健康和饮食安全。

食品中椰毒假单胞菌酵米亚种实时荧光PCR检测的研究

目的建立食品中椰毒假单胞菌酵米面亚种实时荧光PCR检测方法。方法根据椰毒假单胞菌酵米面亚种16S^23S rRNA基因片段序列,用Oligo7设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,摸索最佳退火温度,最佳引物和探针浓度,建立椰毒假单胞菌酵米面亚种实时荧光PCR检测方法。通过对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌以及22种其他标准菌株进行实时荧光PCR检测,验证本法的特异性和抗干扰性。同时从菌液浓度和DNA浓度水平上进行研究,确定该检测方法的灵敏度。结果用该方法检测23种菌,除唐菖蒲伯克霍尔德氏菌外,其他22种细菌均为阴性。抗干扰性试验显示杂菌对检测结果不影响,本法抗干扰能力强。通过灵敏度试验的研究,确定本法检测椰毒假单胞菌酵米面亚种的菌液灵敏度为1×10^2 CFU/mL,DNA灵敏度为250 fg/μL。结论本试验设计的引物和探针具有较强特异性、抗干扰性以及灵敏度,该方法具有很好的研究价值和应用前景。

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的研究进展

文章对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)命名历程、生物学特性、污染食品中毒作用机理、消毒和去毒及预防中毒措施等方面内容进行了综述,并展望了未来研究的方向。

椰毒假单胞菌酵米面亚种菌株保存方法的研究

用ｐＨ６．８磷酸盐缓冲液鸡蛋斜面、ＰＤＡ斜面和玉米粉３种材料，覆以液体石蜡作保存椰酵假单胞菌效果研究，结果以ｐＨ６．８磷酸盐级冲液鸡蛋斜面覆以液体石蜡，放于室温或４℃冰箱，被保存菌株１６个月或１２个月仍存活，而且保存后菌种的生物学特性与保存前相比未见明显变异。

云南省文山州广南县吊浆粑食物中毒事件的病原学分析

目的分析云南省文山州广南县一起吊浆粑食物中毒事件,鉴定引起中毒的致病因素。方法在流行病学调查的基础上,对采集的4份食物样品参照GB/T 4789.29—2003进行微生物常规培养,对其中分离的疑似目标菌株进行VITEK 2 COMPACT生化鉴定和16S rRNA序列比对,并对样品进行动物中毒试验,采用液相色谱-质谱联用方法对样品中的米酵菌酸进行定量分析。结果分离的3株食源性致病菌的16S rRNA序列比对和VITEK 2COMPACT生化鉴定结果均为唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli),均可产毒使小鼠死亡,且样品中米酵菌酸含量超标,产毒量最高达9.67 mg/kg。结论该食物中毒事件是由唐菖蒲伯克霍尔德菌污染吊浆粑,产生大量米酵菌酸所致。从试验过程和结果分析,该菌株应为我国命名的椰毒假单胞菌酵米面亚种(Pseudomonas cocovenenans subsp.farinofermentans)。

椰毒假单胞菌酵米面亚种选择性分离培养基的比较研究

目的比较4种椰毒假单胞酵米面亚种选择性分离培养基(马铃薯葡萄糖琼脂,PDA;改良马铃薯葡萄糖琼脂,mPDA;椰毒假单胞菌酵米面亚种分离琼脂,PCFA;银耳卵黄氯霉素琼脂,TYCA)的分离效果,为修订GB/T4789.29—2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》提供技术支持。方法接种椰毒假单胞菌酵米面亚种于4种选择性分离培养基,观察各培养基上目标菌菌落形态,计算生长率;接种10种常见致病菌和环境中常见菌于4种选择性分离培养基,进行生长特异性试验;通过直接涂布和增菌划线的加标试验,验证这4种选择性分离培养基对粪便、食品和环境土壤等不同标本/样品中椰毒假单胞菌酵米面亚种的分离检出情况。结果 mPDA和PCFA能够分别抑制8种和6种致病菌的生长,且椰毒假单胞菌酵米面亚种的生长率都高于75%;在mPDA和PCFA上,目标菌与多数杂菌形态有明显区别,而在PDA和TYCA上,形态相近不易区分;在粪便、土壤和食品等不同标本/样品的直接涂布和增菌划线分离的加标试验中,mPDA和PCFA上的检出率均超过80%,明显高于PDA和TYCA。结论 mPDA和PCFA分离效果比原标准的PDA明显提高,建议在标准修订中增加此两种选择性分离培养基。

椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒的病原分离鉴定

目的通过对食物中毒病原菌的分离鉴定,为查明中毒原因提供科学依据。方法分离鉴定和毒性试验按照国家标准方法 WS/T 12—1996《椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒诊断标准及处理原则》和GB/T 4789.29—2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》进行。米酵菌酸检测按照GB/T 11675—2003《银耳卫生标准》执行,采用液相色谱-质谱联用法对样品开展检测。结果经VITEK 2 COMPACT全自动微生物生化鉴定仪和基因指纹鉴定仪进行鉴定,4份样品中3份鉴定结果为唐菖蒲伯克霍尔德菌,小鼠毒性试验阳性。4份样品均检测出米酵菌酸。结论本次食物中毒源于食源性椰毒假单胞菌酵米面亚种污染。

2018—2020年广东省河粉类食品米酵菌酸中毒事件流行病学分析

目的分析广东省河粉类食品相关米酵菌酸中毒的流行病学特征,为米酵菌酸中毒的预防控制提供科学依据。方法采用描述流行病学方法,对广东省河粉类食品相关米酵菌酸中毒事件进行分析。结果2018—2020年广东省共报告5起因食用河粉类食品引起的米酵菌酸中毒事件,中毒21人,死亡9人,病死率为42.9%;临床特征出现较多的症状是呕吐、腹泻、腹痛;主要发生在第三、四季度。广东省5起米酵菌酸中毒事件涉事食品均为食品加工厂批量生产的湿淀粉制品或湿大米制品,且发现涉事河粉存在异于传统的特点:添加了较大量的淀粉;使用了脱氢乙酸钠;在常温下保存超过24 h,但并没有明显的腐败变质。结论该5起河粉类食品中毒事件是罕见的由加工食品引起的米酵菌酸中毒,需要进一步分析该类食品生产经营过程的薄弱环节、提出针对性的控制措施,同时加强消费提示和食品安全知识宣教,引导生产经营者、消费者合理保存食品,并在保质期内销售和食用。