类产碱假单胞菌谷氨酸脱氢酶的提纯、鉴定及某些特性的初步研究

从类产碱假单胞菌纯化出电泳纯的谷氨酸脱氢酶，用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳和ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测得分子量为２９０ ｋＤ，亚基分子量为４７ ｋＤ，提示该酶为六聚体．该酶对ＮＡＤＰ（Ｈ）和底物均具有高度专一性，对谷氨酸、α－酮戊二酸及ＮＡＤＰ＋ 的Ｋｍ 值分别为：２８ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ、１．２ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ及０．０６３ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ．用Ｈｉｌｌ作图法求得酶对ＮＨ＋４ 和ＮＡＤＰＨ 的［Ｓ］０．５分别为２４ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ和０．０３７ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ．最适反应温度为５０℃，催化氨化反应和脱氨反应的最适ｐＨ 分别为８．０和８．８，在热稳定性方面不及嗜热细菌的谷氨酸脱氢酶稳定．提纯的谷氨酸脱氢酶在低温（４℃）条件下，可在Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液中贮存半年以上，活力无明显下降，冷冻则可导致纯酶液迅速失活．氮源对菌体谷氨酸脱氢酶水平有显著影响．

类产碱假单胞菌谷氨酸脱氢酶酶学性质的研究

类产碱假单胞菌的谷氨酸脱氢酶水平受氮源调节，以氨为唯一氮源时酶水平有明显提高．研究表明，该酶的最适反应温度为５０℃，催化氨化反应和脱氨反应的最适ｐＨ值分别为８．０和８．８．

类产碱假单胞菌谷氨酸脱氢酶的纯化和性质

Glutamate dehydrogenase was purifiedfrom thecrudeextract of Pseudomonas pseudoal caligenes.Theenzyme had a molecular weight of 290 000 and was composed of six subunits with identical molecular weightof47 000 . The enzyme was highly specific for NADP(H) and the sub strates.The biochemicalpropertiessuch askineticparametersand heatstability werealsoexamined. The purified GDHshowed considerableloss ofactivity uponfreezing.

艰难梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶的原核表达、纯化及其酶活性

目的原核表达艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile,CD)谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GDH),纯化重组蛋白,并检测其酶活性。方法采用PCR法从标准株ATCC BAA-1805中扩增GDH基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28-GDH,转化感受态大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,并通过Ni-NAT层析柱分离纯化后,根据脱氢酶酶活测定方法,测定纯化蛋白的酶活性。结果重组表达质粒pET-28-GDH经双酶切及测序,证实构建正确,重组蛋白的相对分子质量约46 000,可与抗His单抗特异性结合,主要以可溶性形式表达。纯化的目的蛋白纯度可达90%,浓度为1.7 mg/ml。纯化蛋白GDH以NADPH和NADP为辅酶,酶活性分别为42.6和63.3 U/L。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CD GDH,纯化的目的蛋白纯度高,具有GDH酶活性,为制备GDH单克隆抗体奠定了基础。