Pseudomonas stutzeri A1501基因组结构及功能注释

采用全基因组"shotgun"方法完成了固氮斯氏假单胞菌A1501的全基因组序列测定,并进行了基因组结构与功能注释分析。A1501基因组全长4 567 418 bp,含有4 146个ORFs。该基因组中已鉴定了42个编码转座酶的重复序列,这些序列的存在预示着转座现象在A1501菌中非常活跃,预示该菌与其他生物之间基因交流可能比较频繁。比较基因组表明,为了适应特定的生存环境,假单胞菌在基因组结构和遗传信息容量上产生了明显的分化。此外,基因组分析鉴定了A1501环境适应的遗传基础,包括物质转运、信号传导和趋化系统等,这些系统是细菌能够在根际土壤环境中保持竞争力以及能够与水稻形成高效联合固氮体系的关键。A1501基因组的完成为进一步开展功能基因组学和蛋白质组学研究奠定了基础。

光驱动Pseudomonas stutzeri-CdS半人工光合系统固氮产氨效果与机制

基于微生物-半导体的半人工光合系统能高选择性、高效地利用太阳能驱动微生物固碳、产氢及反硝化,受到了广泛的关注.然而,利用半人工光合系统驱动微生物固氮产氨却鲜见报道.本研究成功构建了Pseudomonas stutzeri-CdS(P.stutzeri-CdS)半人工光合系统,其具有捕获光能并还原N_(2)成氨的能力.光照时,CdS产生的光电子传递至胞内,参与P.stutzeri固氮过程.结果显示,光照5天后,P.stutzeri-CdS系统中NH^(+)_(4)的产量达(2.03±0.07)mg/L,是对照组的2.91~7.37倍.光照系统表现出了明显的乙炔还原酶活性,产生的乙烯量是对照组的6.2~100倍,证明了P.stutzeri-CdS光照过程中的固氮酶活性.同时,实时荧光定量PCR技术进一步证实了光照时,P.stutzeri-CdS中固氮酶基因nifA,nifD,nifH,nifK的相对表达丰度呈显著上调(1.41~2.35).蛋白酶K添加处理实验表明,该系统中胞外光电子传递至胞内不依赖于胞外蛋白,可能为小分子氧化还原介体介导的传递过程.本研究为发展高效、经济、绿色的氨生产提供了一种新思路,为理解自然界的氮循环过程提供新视角.

固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运调控基因dctB的功能研究

为研究固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501四碳二羧酸转运相关基因dctB的生物学功能,构建了携带功能完整的dctB基因片段的广宿主质粒pLL2922,通过三亲接合将该质粒转移至dctB突变株及野生型菌株A1501,并对其以琥珀酸、延胡索酸、苹果酸等四碳二羧酸为唯一碳源的培养基中的生长情况与固氮活性进行了测定.结果表明:dctB突变株不能利用琥珀酸和延胡索酸进行生长和固氮,但能以苹果酸为唯一碳源进行生长和固氮.携带功能完整dctB的广宿主质粒pLL2922,可以互补dctB位点的突变,并部分恢复突变株的四碳二羧酸转运和固氮能力.将该质粒转入A1501野生型菌株可以提高A1501的固氮活性,在琥珀酸,延胡索酸,苹果酸为唯一碳源的培养基上固氮活性比野生型菌株提高62.8%,33.9%,27.8%.表明dctB基因对于四碳二羧酸的转运及固氮能力均具有重要作用.

施氏假单胞菌在玉米根际的固氮效率和促生效果研究

非豆科植物根际联合固氮作用广泛存在于水稻、玉米等根际,在农作物节肥增产方面具有巨大的应用潜力。施氏假单胞菌A1501是一株分离自水稻根际的模式联合固氮菌,接种该菌对水稻和玉米均具有良好的促生效果。为了进一步研究根际固氮与促生效果的关系,利用突变型泌铵固氮菌株(1568/pVA3)和转基因氮高效利用玉米品系共同构建高效固氮体系,并在温室条件下进行促生及生物固氮量评价。播种60 d后对玉米生长量和微生物固氮量进行分析,结果表明:固氮施氏假单胞菌接种后氮高效利用和对照玉米品系的地上和地下部生物量都显著高于不接种对照,但是固氮菌接种对氮高效利用玉米和对照玉米的总生物量没有显著影响。氮高效利用玉米接种1568/pVA3菌株后,植株生物量较施肥处理提高25.5%,全氮含量较不接种对照增加39%,15N同位素稀释法测定生物固氮量为0.8 g·株^(-1);接种野生型后植株生物量较施肥处理提高24.8%,生物固氮量为0.64 g·株^(-1)。研究结果表明,通过将固氮菌尤其是泌铵工程菌与氮高效利用玉米建立联合固氮体系可以显著提高根际固氮量和植株生物量,据估算每公顷可节省化肥约23%,而对照体系为7.5%。

转dct结构基因固氮斯氏假单胞菌工程菌株构建及其特性研究

固氮斯氏假单胞菌 (Pseudomonasstutzeri)A15 0 1是一种定殖于水稻根部的联合固氮菌。将含有A15 0 1四碳二羧酸转运系统 (Dct transportsystem)结构基因dctPQM的亚克隆大片段克隆到具有广泛宿主范围转移特性的质粒载体 pSZ2 1上。通过三亲接合试验 ,重组质粒 pSZY6中所携带的dctPQM基因随机转座插入到菌株A15 0 1的染色体基因组中 ,构建了含有额外拷贝dct结构基因的遗传工程菌株。在A15卡那霉素 (5 0 μg/mol)平板上 ,共筛选到约 6 0株转接合子。其中工程菌株A 136、A 115和A 14 2在以不同的四碳二羧酸如琥珀酸、延胡索酸和苹果酸 ,以及乳酸为唯一碳源生长时 ,表现了较高的固氮活性 ,其固氮水平明显高于野生型菌株A15 0 1。

斯氏假单胞菌A1501物质代谢及能量生成相关基因的分析

斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501是一株分离自中国南方水稻根际土壤的联合固氮菌。该菌在无氨和微好氧条件下可将空气中的氮气转化为植物可以直接利用的铵。A1501基因组测定工作已经完成,根据A1501菌基因组的功能注释对该菌的中心代谢、能量合成及环境适应性等方面进行了生物信息学分析。结果发现,A1501菌的物质代谢途径具有多样性,除不能利用EMP途径代谢己糖外,该基因组含有几乎所有编码Entner-Doudorff途径(ED)、磷酸戊糖途径(HMP)、糖酵解途径(EMP)、三羧酸循环(TCA)以及乙醛酸途径中关键酶类的基因。此外,基因组分析鉴定了252个与能量产生相关以及3套编码电子传递复合体(1个Nqr和2个Rnf复合体)的基因簇。为进一步研究A1501菌的碳代谢调控及C-N偶联机制提供了重要的理论依据。

施氏假单胞菌A1501铁吸收调节蛋白Fur的表达特性与功能鉴定

铁是细胞生理代谢的重要金属元素,是多种氧化还原酶类、过氧化物酶类的重要组成部分。革兰氏阴性菌中,胞内铁转运、储存和利用主要由铁吸收调节蛋白Fur(ferric uptake regulator)调控。水稻根际联合固氮菌--施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501基因组中含有一个fur同源基因,但其具体功能尚不清楚。比较了A1501中fur基因及其编码蛋白的序列特征,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative,qRT-PCR)和Western blotting杂交方法测定了fur基因和Fur蛋白的表达特性,结果发现fur基因表达水平与环境中铁浓度呈负相关,在铁限制条件下高表达,铁过量条件下表达受抑制。构建了fur基因突变株和功能回补株,表型测定发现fur突变影响了A1501的碳源代谢谱,并导致A1501对过氧化氢胁迫敏感。胞内铁含量测定表明,fur突变株内的铁含量为野生型的1.3倍,进一步qRT-PCR测定表明fur突变影响了铁离子转运系统及过氧化物酶编码基因的表达。研究结果为解析根际微生物胞内铁平衡调节及根际环境适应机制奠定了理论基础。

固氮施氏假单胞菌全局性调控因子RsmA的进化分析及表达特性研究

RsmA是假单胞菌属高度保守的全局性调控因子,该蛋白可通过与靶基因的mRNA结合影响其稳定性或者抑制靶基因的翻译影响蛋白表达。固氮施氏假单胞菌A1501中发现一个rsmA同源基因及一个可能参与rsmA活性调节的非编码小RNA rsmZ基因。对A1501菌中RsmA及RsmZ的分子进化及表达特性进行了研究。分析结果表明,RsmA与铜绿假单胞菌同源性可达98%,RsmZ具有4个RsmA的结合位点。实时定量RT-PCR结果显示,rsmA在生长初期具有高表达量,而在指数生长期以及平台稳定期表达量下降。非编码RNA rsmZ的转录水平在整个生长时期未发生显著变化。在碳匮乏条件下,rsmA和rsmZ的表达量都显著下调。在一般胁迫σ因子rpoS突变株中,rsmA的表达未受影响,但rsmZ表达上调了30多倍,说明rsmZ的表达受rpoS的负调控。进一步发现,A1501菌中,rsmA和rsmZ的转录不受转录调控因子gacA突变的影响,这与荧光假单胞菌CHAO和铜绿假单胞菌PAO1的调控模式区别,表明RsmA的转录调控模式在固氮施氏假单胞菌A1501中有其独特性。该结果为进一步探索固氮施氏假单胞中RsmA的功能及其特定条件下的调控机制奠定了理论基础。

斯氏假单胞菌A1501固氮新基因PST1305的功能分析

【目的】研究斯氏假单胞菌A1501基因组"固氮岛"中PST1305基因在A1501生物固氮过程中所起的作用。【方法】利用同源重组与三亲接合的方法构建PST1305的非极性突变株。乙炔还原法测定固氮酶活。RT-PCR分析PST1305基因与其周围基因转录单元的关系,Real-TimePCR比较PST1305在最佳固氮与非固氮条件下表达水平的差异。【结果】突变株np1305的固氮酶活显著降低,功能互补菌株np1305 Comp能基本恢复细胞的固氮作用。PST1305与其上游的nifB、fdxN、下游的nifQ等基因位于同一个转录单元,组成一个操纵子。基因芯片表明,PST1305基因在固氮比非固氮条件下表达量显著上调(约38.7倍),Real-Time PCR验证支持这一结果。【结论】PST1305基因参与固氮过程,其突变会影响固氮酶的活性,该基因可能通过参与A1501固氮酶电子传递或者固氮酶的氧保护过程影响固氮效率。