伪狂犬病毒gI基因的克隆表达及其对病毒增殖的影响

从伪狂犬病毒 (PRV)国内地方分离Ea株基因组DNA片段中克隆了完整的gI基因 ,序列分析结果表明 ,gI基因编码区全长 1 1 0 1bp ,可编码 3 6 6个氨基酸残基 ,二级结构预测具有典型I型膜蛋白特征。与GenBank中收录的国外Rice株的同源比较发现 ,Ea株gI在核苷酸和氨基酸水平上均存在多处突变 ,尤其是潜在胞浆区中连续两个碱基的缺失导致移码突变 ,致使gI基因的读码框架后移 ,从而导致Ea株gI较rice株长 1 6个氨基酸残基。将gI基因克隆到真核表达载体pcDNA3 1 +中的人巨细胞病毒早期启动子下游 ,构建的真核表达质粒转染PK 1 5细胞 ,间接免疫荧光检测证实gI获得正确表达。进一步测定天然缺失gI的PRV弱毒Bartha株在表达gI细胞系和空白载体转染的对照细胞系中的蚀斑形成单位 (pfu)和组织细胞培养半数感染量 (TCID50 ) ,结果显示 :Bartha株在表达gI细胞系中的pfu和TCID50 分别为对照细胞系的 1 6 4 %和 2 0 0 %。

伪狂犬病病毒Ea株gE基因的克隆、序列分析及其表达

对含伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PrV）Ea株gD基因部分编码序列,gI、gE和11k基因全序列、28k基因部分序列的质粒pSKB4.5进行亚克隆,构建了只含完整gE基因（长1.78kb）的重组质粒pSDM1.78+,并采用双脱氧末端终止法对全序列进行了分析,发现同国外标准毒株Rice株相比较,在核苷酸和氨基酸水平均存在一定程度的差异。进一步将gE基因克隆到高效真核表达载体pcDNA3.1+的KpnI和BamHI位点之间,构建了gE基因的真核表达质粒pcDNA-gE。体外转染 IBRS-2细胞,经间接免疫荧光法检测证实了gE基因在IBRS-2细胞中得到了表达,表达的蛋白具有生物学活性。

伪狂犬病病毒鄂A株gC基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以伪狂犬病病毒国内地方分离株 (鄂A株 )为材料 ,采用核酸杂交、DNA重组技术直接从基因组DNA中克隆了最主要的保护性抗原基因gC ,测定了全序列并对其原核表达产物作为血清学诊断抗原进行了初步探讨。结果表明 :所克隆的 gC基因全长 175 5bp(含启动子序列和 poly(A)信号序列 ) ,具有典型I型膜蛋白结构特征。同具有代表性的国外标准株NIA 3株、IndianaS株相比 ,多个酶切点不同 ,尤其是具有分型意义的BamHI位点消失 ;氨基酸水平上也存在一定程度的差异 ,鄂A株 gC可编码 4 87个氨基酸残基 ,而以往所报道的gC均只编码 4 78或 4 79个氨基酸 ,有意义的是功能区突变较多 ,并存在连续 7个氨基酸残基的插入。同 pET 2 8a的 6xHis Tag融合的gC基因完整编码区在大肠杆菌中获得高效表达 ,融合蛋白分子量为 6 2ku ,能同伪狂犬病病毒高免血清发生特异性反应。纯化的表达产物作为ELISA和乳胶凝集诊断抗原 。

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gK基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达

根据伪狂犬病病毒 (PRV) Ka株序列 ,合成 1对包含 g K基因完整编码区的引物 ,以 PRV Ea株 Bam H 5′片段为模板 ,扩增出 0 .9kb特异性带。将纯化的扩增产物克隆到 p Bluescript SK+ 中 ,构建了重组质粒 p SKg K,用双脱氧末端终止法进行序列测定 ,并同国外 Ka株进行比较。结果表明 ,Ea株 g K基因全长 939bp,编码 313个氨基酸 ,与 Ka株比较 ,Ea株 g K基因有 2 2处点突变 ,但无插入突变和缺失 ,同源性达 97.78%。将 g K基因克隆到原核表达载体p GEX- 2 T中 ,构建了 g K全基因原核表达载体 p2 Tg K939。再用 Bam H 、Xho 酶切 p2 Tg K939,回收 5 88bp g K小片段 ,克隆到原核表达载体 p GEX- KG中 ,构建了 g K部分基因原核表达载体 p KGgk5 88。经 IPTG诱导 ,g K全基因不表达 ,而 g K部分基因表达约 4 0 0 0 0融合蛋白。用 PRV高免血清经 Western blotting证明 ,g K有免疫原性。提取 g K包涵体并制备高免血清 ,EL ISA检测抗体效价为 1∶ 6 4

伪狂犬病病毒糖蛋白G基因的结构分析及其原核表达

利用PCR技术扩增了伪狂犬病毒湖北株 (PRVHB)糖蛋白G(gG)基因 ,进行了序列测定和分析。结果显示扩增和测序片段长 180 4bp ,G +C含量 6 8.78%。gG基因ORF长 15 0 0bp ,编码 5 0 0个氨基酸组成的多肽。与PRVRice株 gG基因比较 ,两者核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为 98%、84.1%。 32 0～ 380位之间的氨基酸序列存在较大差异。根据序列分析结果 ,选取 gG基因长短不同的两个片段分别克隆到原核表达载体 pET2 8a(+)进行表达。经SDS PAGE和Dot ELISA分析证实 ,表达出分子量大小分别约为 5 5kD和 6 3kD的特异性gG多肽 ,这为深入阐明PRV gG基因结构与功能及研制 gG

伪狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达

本研究以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,PCR扩增含UL18全长基因的片段并克隆至pMD18-T载体,采用双脱氧末端终止法测序。序列分析显示UL18全长891bp,可编码297个氨基酸。将该基因亚克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His标签下游,获得原核表达质粒pQE-UL18,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白6×His-UL18的分子量约为33ku。Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。进一步将UL18基因插入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL18,转染HeLa细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染后24h融合蛋白EGFP-UL18主要定位于细胞浆,仅有部分定位于细胞核,而48h时则主要定位在细胞核,但对照载体pEGFP-N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞中。

传染性喉气管炎病毒WG株糖蛋白gJ基因的克隆与表达

根据GenBank中已发表的传染性喉气管炎病毒全基因组序列(NC006233)设计引物,以传染性喉气管炎病毒WG株基因组为模板,PCR扩增糖蛋白gJ基因,并对其进行序列分析。用DNAStar软件分析gJ蛋白的抗原性,选择抗原性强的140aa～483aa片段,克隆并连接到原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)菌株。经IPTG诱导后,获得大小为65.2ku的重组蛋白,命名为r-gJ,表达量占菌体蛋白总量的60.8%;Western blot分析表明r-gJ具有较强的抗原性。

伪狂犬病病毒Ea株EP0基因的克隆序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以伪狂犬病病毒Ea株 (PRV Ea)细胞感染物为模板 ,PCR扩增出 1.2 3kb的EP0基因完整编码区片段 ,将该基因片段克隆到 pBluescriptⅡsk +中并构建三个测序质粒 ,双脱氧末端终止法序列测定并同国外InFh株进行同源比较 ,发现PRV EaEP0基因存在多处点突变和一处缺失突变 ,但无插入突变和移码。进一步将该片段插入到原核表达载体 pET 2 8a的His Tag下游 ,构建的原核表达质粒pETEP0在大肠杆菌BL2 1(DE3)中获得了高效表达 ,SDS PAGE结果显示 ,表达的蛋白分子量为 6 2kD ,并形成包涵体。Western印迹分析表明 ,该蛋白带能与Ea株野毒高免血清发生特异性反应 ,证实PRV EaEP0基因在BL2 1(DE3)中获得了正确表达 ,并且具有免疫学活性。为今后深入研究该基因的功能奠定了基础。

伪狂犬病病毒Ea株UL14基因的克隆、序列分析及表达

从伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA中克隆含UL14基因的BamHⅠ第3片段并进行序列分析。根据测定的序列设计1对能扩增UL14基因完整编码区的引物,PCR扩增UL14基因并将其插入原核表达载体pGEX-KG,获得原核表达质粒pKG-UL14,转化BL21(DE3),在IPTG诱导下,GST-UL14融合蛋白获得高效表达,表达产物的相对分子质量为44 000,并以包涵体形式存在。纯化的表达产物免疫兔,获得了针对UL14蛋白的高效价多抗血清。进一步将UL14基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中EGFP基因的3′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL14,转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察发现,转染后24、48 h的融合蛋白EGFP-UL14主要定位在胞浆,但转染后72 h的融合蛋白主要定位在细胞核。上述研究结果为进一步阐明UL14的结构与功能奠定了基础。

伪狂犬病毒Ea株UL38基因的克隆、序列分析及表达

以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL38全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定。序列分析显示UL38基因全长1 107 bp,可编码369个氨基酸。将该基因克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His下游,获得原核表达质粒pQE-UL38,IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达并获得相对分子质量约40 000的融合表达蛋白6×His-UL38,Western blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。进一步将UL38基因插入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP基因的5′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL38,转染Hela细胞,24、48 h通过激光共聚焦显微镜观察显示pEGFP-UL38,24 h荧光主要分布在胞浆,有部分分布在核内,但随时间延长,荧光逐渐向细胞核中转移,在转染后48 h几乎完全定位于核内。但对照载体pEGFP-N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞。

伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的克隆、序列分析及表达

以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL6全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定。序列分析显示UL6全长1 938 bp,可编码646个氨基酸。将该基因克隆到插入原核表达载体pET28a的6×His下游,获得原核表达质粒pET28a-UL6,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导在大肠埃希菌中成功表达获得分子质量约70 ku的融合表达蛋白6×His-UL6,Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生特异性反应。根据测定的序列,设计一对能扩增UL6基因完整编码区的引物,PCR扩增UL6基因并将其插入真核表达载体pEGFP-C2中EGFP基因的3′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL6,转染Hela细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染48 h,融合蛋白EGFP-UL6主要定位在胞浆,为进一步研究伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的结构和功能奠定了基础。

伪狂犬病病毒上海株EP0基因的序列分析及其表达载体的构建

以伪狂犬病病毒上海株 (PRV SH)细胞感染物为模板 ,PCR扩增出 1 2 3kb的EP0基因完整编码区片段 ,将该基因片段克隆到pGEM T easy中 ,经过双脱氧末端终止法序列测定 ,并同国内的PRV Ea株进行同源比较 ,发现PRV SH株EP0基因存在多处突变和一处插入。进一步将该片段插入到原核表达载体 pET32a (+)的His Tag下游 ,构建了的原核表达质粒 pETEP0 ,为今后深入研究该基因的表达及其功能奠定了基础。

猪源伪狂犬病病毒AH02LA株糖蛋白的基因序列测定与对比分析

为了分析猪源伪狂犬病病毒AH02LA株糖蛋白的基因序列特征,本研究设计了17对特异性引物,通过PCR扩增AH02LA株的11个糖蛋白基因并进行序列测定,然后将其与PRV变异株(TJ株与HeN1株)和PRV经典株(Bartha株与Kaplan株)作比对分析。结果:成功扩增了11个糖蛋白基因序列,序列比对发现,AH02LA株的gB、gD、gG、gK和gM基因与PRV变异株的同源性为100%,而与PRV经典株的同源性为98%~99%;AH02LA株的gC、gE和gI基因与PRV变异株的同源性为99%,而与经典株的同源性为95%~97%,而且AH02LA株的gB、gC、gD、gE、gI和gN基因的插入或缺失也与变异株完全一致。研究表明,AH02LA株的主要糖蛋白基因序列与变异株高度同源,该毒株是一株典型的变异株。