检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法的建立及初步应用

为建立快速检测H6亚型禽流感病毒的血清学方法,试验利用前期制备的两株抗H6亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体,建立检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法,并进行特异性、灵敏度、稳定性试验以及对活禽市场采集的48份咽拭子样品的检测效果。结果显示:该ELISA方法只与H6亚型禽流感病毒反应,而与H1、H3、H4、H5、H7、H9、H10、H12等其他亚型禽流感病毒,血清4型禽腺病毒、血清8b型禽腺病毒、血清3型鸭腺病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、鹅星状病毒、小鹅瘟病毒、传染性法氏囊病病毒以及禽白血病病毒均无交叉反应;该ELSIA方法可检测2.32×10^(4)TCID50/mLH6亚型禽流感病毒,批间和批内重复试验变异系数均小于10%;该ELISA方法和RT-PCR方法对活禽市场采集的48份咽拭子样品检测结果一致,进一步检测攻毒鸡的咽拭子显示该方法可有效检测咽拭子中H6亚型禽流感病毒。研究表明,基于两株单克隆抗体建立的检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法具有特异性强、灵敏度高的特点,适用于H6亚型禽流感病毒感染的临床检测。

检测伪狂犬病病毒双抗体夹心间接ELISA方法的建立与应用

以猪伪狂犬病病毒(PrV)Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体,纯化的抗PrVIgG为检测抗体,建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为,单克隆抗体576株的包被浓度为12.2μg/mL,IgG的工作浓度为16.0μg/mL,对PrV的检测灵敏度达15.6ng(0.156μg/mL),与乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪流感病毒(SIV)等无交叉反应。批间和批内变异系数较小,分别为6.39%和4.1%。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测,肺和脑PrV抗原检出率最高,其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PrV对159份临床样本进行平行检测,发现二者的符合率可达到77.4%,比PCR敏感。实验结果表明:双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点,可广泛应用于动物组织中PrV的检测。

兔出血症病毒双夹心ELISA检测方法的建立

为建立特异性好、敏感度高、稳定可靠的检测兔出血症病毒的双夹心ELISA方法。该试验制备了兔出血症病毒多抗和小鼠腹水单抗,并将他们提纯。用方阵法筛选最佳反应浓度,用特异性试验、敏感度试验和重复性试验对该方法进行鉴定,并同时用双夹心ELISA和血凝试验(HA)对52份待测兔肝脏样品进行检测,比较这两种方法的符合率。结果显示:兔出血症病毒多抗最佳稀释度为1∶400,浓度为19.50 mg/L;单抗的最佳稀释度为1∶800,浓度为2.86 mg/L。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法特异性强、敏感度高。对52份待检兔肝脏样品的检测结果显示:双夹心ELISA和HA试验的阳性检出率分别为82.7%(43/52)和75.0%(39/52),双夹心ELISA与HA试验的符合率为90.7%。用不同批次包被的酶标板重复检测已知样品显示出良好的重复性。以上试验结果表明该双夹心ELISA方法是检测RHDV的一种特异、敏感、快速、经济的免疫学检测技术。

牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

将牛病毒性腹泻病毒超免疫血清以常规方法提取IgG,采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP),建立了从粪样中检测牛病毒性腹泻病毒抗原的双抗体夹心ELISA。结果,抗体的最佳包被量为150μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1∶200;封闭液为50mL/L的兔血清;待检粪样及酶标抗体的感作时间为37℃120min;底物显色时间为室温15min。应用建立的检测方法对河北省8个大中型奶牛场298份乳牛腹泻粪样进行了检测,结果,阳性检出率为42.6%。

双抗体夹心ELISA检测伪狂犬病病毒的研究

建立了检测伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ。试验方法的最佳工作条件为，抗体包被量为５μｇ／孔，酶标抗体的浓度为１２００。对人工感染兔和自然感染猪的组织脏器检测，结果发现扁桃体、脑和肺的检出率最高，其次为心、肝、脾、肾等组织。

猪传染性胃肠炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速检测方法,本研究以抗TGEV N蛋白单克隆抗体(MAb)为包被抗体,纯化的抗TGEV N蛋白多克隆抗体(PcAb)为检测抗体建立了TGEV双抗体夹心ELISA方法,优化其反应条件为:抗TGEV N蛋白MAb包被浓度为0.4μg/mL,抗TGEV N蛋白PcAb和酶标二抗的工作浓度分别为3.5μg/mL和1∶5 000,以P/N>2,同时OD490nm≥0.316作为阳性判定标准。该ELISA的重复性变异系数小于10%,与猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪轮状病毒等无交叉反应。对22份临床猪粪便样品RT-PCR的阳性检出率为31.8%;ELISA的阳性检出率为22.7%,二者符合率达81.8%,结果表明本研究建立的双抗体夹心ELISA方法检测TGEV具有较高的特异性和敏感性,可以用于TGEV的病原学检测。

双抗体夹心酶联免疫吸附试验(S-ELISA)检测血吸虫病人循环抗原的研究

应用从重感染兔血清中提取的γ-球蛋白为捕捉抗体、以酶标单克隆抗体为结合物进行双抗体夹心酶联免疫吸附试验(S-ELISA),检测日本血吸虫病人循环抗原.结果:69例急性血吸虫病人血清的阳性率为80.6%一90.9%;110例慢性血吸虫病人血清的阳性率为88.2%;40例华支睾吸虫病人血清有1例出现阳性,交叉反应率为2.5%,50例健康人血清亦有1例出现阳性反应,假阳性率为2%.提示该法具有较高的敏感性、特异性,判断结果较客观,可应用于现场.

重组人类T淋巴细胞白血病病毒抗原及双抗原夹心法ELISA抗体诊断试剂盒的研制

为研制灵敏、特异的抗人类T淋巴细胞白血病病毒(HTLV)抗体诊断试剂,将一段HTLV Ⅰ和HTLV Ⅱenv区嵌合基因在大肠杆菌中表达,获得的重组抗原具有良好活性。将该抗原作为酶标记抗原建立双抗原夹心法ELISA(dsELISA),对31份HTLV Ⅰ型血清和19份HTLV Ⅱ型血清均能100%检出,而在5065份各种阴性血清中特异度为99 94%。用dsELISA试剂与进口间接法试剂(GeneLabs试剂)平行检测18份HTLV Ⅰ参比血清、17份HTLV Ⅱ参比血清和1024份献血员血清,结果dsELISA试剂正确率为100%,对HTLV Ⅰ型血清和HTLV Ⅱ型血清的反应性基本相同,平均s/co值显著高于GeneLabs试剂。而GeneLabs试剂对HTLV Ⅱ型血清的反应性显著弱于Ⅰ型,并有2份BBI参比血清中的Ⅱ型血清漏检。另外,GeneLabs试剂在献血员血清中出现9例假阳性,特异性显著低于dsELISA试剂。这些结果表明:所研制的dsELISA试剂可用于HTLV Ⅰ型和Ⅱ型血清的检测,其灵敏度和特异度均优于进口间接法诊断试剂。

蓝舌病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用将纯化的蓝舌病病毒(BTV)免疫BALB/c小鼠,分离免疫鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了3株(1F5、4E5和6A1)可以稳定分泌抗BTV VP7特异性单抗的杂交瘤细胞株。用纯化的BTV免疫家兔,按常规方法制备BTV多抗。选用抗VP7单抗(1F5)包被ELISA板,用兔抗BTV多抗作为捕获抗体,建立了BTV双抗体夹心ELISA检测方法。用该ELISA方法分别检测BTV、鹿流行性出血病病毒、水疱性口炎病毒、赤羽病病毒、小反刍兽疫病毒阳性样品。结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性。用该ELISA和RT-PCR同时检测259份临床样品,ELISA的特异性和敏感性分别为99.1%和85.7%,两种方法的符合率为97.7%。该方法的建立为BTV的检测及蓝舌病的流行病学调查提供了有效工具。

戊型肝炎病毒抗体双抗原夹心法ELISA的建立与初步应用

目的 建立抗戊型肝炎病毒 (HEV)抗体检测的双抗原夹心ELISA(DS -ELISA) ,并应用于多种动物血清的检测。方法 将大肠杆菌表达的一段HEVORF2区重组抗原分别包被微孔板和进行辣根过氧化物酶 (HRP)标记 ,利用 5份阳性血清和 4 0份阴性血清建立双抗原夹心ELISA ;用 4 0 0份义务献血员血清比较双抗原夹心ELISA与间接法IgG抗体ELISA的符合情况 ;用 3只HEV感染猴系列血清比较双抗原夹心ELISA试剂和Genelabs公司HEVIgG试剂 ;用双抗原夹心ELISA试剂检测新疆地区的部分牛、绵羊、山羊、猪血清和上海地区的部分鸡血清中的HEV抗体。结果 建立了检测HEV抗体的双抗原夹心ELISA方法 ,对 4 0 0份义务献血员血清的检测表明其与间接法IgG抗体ELISA试剂的符合情况良好 ,并且有更高的s/co比值 ;与Genelabs公司HEVIgG试剂的比较表明双抗原夹心ELISA试剂的检出更早 ,尤其是持续时间及强度明显优于Genelabs试剂 ;在所检测的各种动物中均发现了HEV抗体 ,其中猪抗体的阳性率最高 ,表明双抗原夹心ELISA试剂可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。结论 利用大肠杆菌表达的HEV重组抗原建立了双抗原夹心法ELISA ,并可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。

双抗原夹心ELISA检测抗HCV总抗体

目的建立检测抗HCV抗体的双抗原夹心ELISA法,评价其可行性。方法将与His或GST融合表达的HCV基因工程抗原,分别用作ELISA的包被和酶标记抗原,建立用于抗HCV总抗体检测的双抗原夹心ELISA。用此方法检测1 968份临床血清标本,并以间接ELISA(北京万泰试剂)与之对照;此外,用套式RT-PCR检测部分血清的HCV RNA。结果有1 761份血清2种ELISA检测均为阴性,有190份血清均为阳性,两种方法符合率为99.1%;有17份血清的检测结果不相符,间接法阳性而本法阴性的14份,其中HCV RT-PCR阳性1份;本法阳性而间接ELISA阴性的3份,其中RT-PCR阳性2份。双抗原夹心ELISA与间接ELISA的敏感性分别为99.48%、98.96%,特异性分别为99.94%、99.27%。结论新研制的检测抗HCV总抗体的双抗原夹心ELISA具有较高的敏感性和特异性,值得作进一步的深入研究。

Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

为建立Asia1型口蹄疫(FMD)快速病原学诊断方法,本研究采用纯化的Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合并筛选到一株能够稳定分泌抗Asia l型FMDV单克隆抗体(MAb)2E10。经间接免疫荧光试验特异性鉴定,2E10为FMDV型特异型MAb。其抗体亚类为Ig G1/资,杂交瘤细胞上清和腹水抗体效价分别为1颐256和1颐104,相对亲和力常数为2.5 mol/L。在此基础上,以本实验室前期制备的MAb 2D8为包被抗体,以HRP标记的MAb 2E10为检测抗体建立了检测Asia1型FMDV抗原的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)方法。该方法针对FMDV细胞毒的最低检出量为103TCID50,对O型FMDV、A型FMDV、牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒及牛传染性鼻气管炎病毒检测结果均为阴性。本研究建立的Asia1型FMDV DAS-ELISA方法为Asia1型FMD病原学诊断试剂盒的研发奠定了基础。

双抗体夹心ELISA法检测狂犬病疫苗抗原活性组分

采用多克隆双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法快速检测狂犬病毒抗原含量。结果表明，灵敏度达到１５μｇ／ｍｌ，同时特异性及变异系数均合乎要求。本方法用于精制狂苗制备过程中有效抗原活性组分的检测准确、快速、重复性好，且抗原的ＥＬＩＳＡ效价与ＮＩＨ动物法测定效价具有平行趋势。

传染性胰坏死病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

以纯化的兔抗传染性胰坏死病病毒(IPNV)VP2重组蛋白多克隆抗体为包被抗体,抗IPNV VP2单克隆抗体为检测抗体建立了IPNV双抗体夹心ELISA方法。优化反应条件为:兔抗IPNV VP2重组蛋白多克隆抗体包被浓度为1.28μg/mL,抗IPNV VP2单克隆抗体的工作浓度为1.34μg/mL,酶标二抗稀释比例为1∶2 000,以P/N>2,且OD490 nm>0.101 494作为阳性判定标准。该方法的重复性变异系数均小于10%,与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、轮状病毒(HRV)无交叉反应。对41份虹鳟肝脏样品分别进行双抗体夹心ELISA和RT-PCR检测,结果双抗体夹心法与RT-PCR法检测符合率为97%,表明本实验建立的双抗体夹心ELISA检测方法检测IPNV具有较高的敏感性和特异性,可用于IPNV的病原学检测。

水泡性口炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立方便快捷的水泡性口炎病毒(VSV)检测方法,本研究以抗VSV单克隆抗体(MAb)为捕获抗体,兔抗VSV多克隆抗体为检测抗体,建立VSV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳工作条件为:抗VSV MAb 1A2的包被浓度为3.09μg/mL,兔抗VSV多克隆抗体和酶标抗体的工作浓度分别为5.16μg/mL和1∶5 000,以OD450nm≥0.231作为阳性判定标准。该ELISA方法对猪水泡病病毒、猪水疱疹病毒及羊传染性脓疱病毒等均无交叉反应;敏感度可达3.125μg/mL(101TCID50);其重复性变异系数小于10%。采用建立的ELISA方法与RT-PCR方法同时检测187份临床样品,符合率达到97.9%,具有良好的相关性。本实验建立的VSV双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高、成本低及方便快捷等优点,可以用于VSV的快速检测。

ELISA定量检测乙型脑炎病毒抗原

目的建立双抗体夹心ELISA定量检测乙型脑炎(乙脑)病毒(JEV)抗原方法,用于乙脑疫苗工序产品抗原含量检测。方法以抗JEV多克隆抗体作为包被物,辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体作为酶标记物,四甲基联苯胺(TMB)-H_2O_2显色,建立双抗体夹心ELISA法。根据已知浓度抗原,确定定量标准曲线,检测样品中JEV抗原含量;并对该方法各项指标进行验证。结果该方法最佳线性范围为12.5～200 U/ml;r=0.9989;定量限度为12.5 U/ml;回收率为85.0%～103.3%;变异系数为4.3%～5.5%;与甲肝疫苗原液、流感疫苗原液、Vero细胞裂解液蛋白、小牛血清、人血清清蛋白均无交叉反应。结论该方法线性好,特异性强,灵敏度高,准确性、重复性和稳定性好,可用于乙脑疫苗各工序产品的抗原定量检测。

J亚群禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

本研究利用J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)gp85单因子血清纯化后的抗体成功建立了检测ALV-J抗原的双抗体夹心ELISA方法(DAS-ELISA)。结果表明,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,对ALV-J抗原的最小检出量为0.165μg/mL。用该法对48份临床血浆样品进行检测,结果与PCR方法的符合率达到85.2%。

SIVp27抗原双抗体夹心ELISA检测方法的研究

目的建立检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法并进行初步应用。方法使用ProteinA亲和层析柱纯化腹水中的SIVp27单抗,用过碘酸钠法对单抗进行辣根过氧化物酶标记。经抗体配对实验确定包被抗体和检测抗体,再用棋盘滴定法确定抗体工作浓度后,探索构建检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA法。应用建立的双抗体夹心ELISA法,对SIV模型猴血浆标本和SHIV模型猴病毒分离培养上清标本进行了检测,并将其结果与Coulter公司试剂盒检测结果进行比较。结果以稀释至20ug/mL的2E12为包被抗体、1:400稀释的酶标3G3为检测抗体为ELISA最优体系。模型猴血浆标本和病毒分离培养上清标本的检测结果表明自建体系可以用于SIVp27抗原的检测,特异性良好,灵敏度略低于Coulter公司试剂盒。结论检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法初步建成,为研制有独立知识产权的检测试剂奠定了一定的基础。

鸡传染性腔上囊病病毒双夹心ELISA检测方法的建立

通过制备兔抗鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)、小鼠抗IBDV和绵羊抗兔免疫血清,并纯化绵羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体,采用方阵滴定法测定其最佳使用浓度,建立了IBDV双夹心ELISA检测方法。结果显示,包被抗体的最适稀释度为1∶160,兔抗IBDV的最佳稀释度为1∶200,酶标记抗体的最佳稀释度为1∶400。特异性和重复性试验结果表明,该方法特异性强,重复性好,与鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡减蛋综合征病毒抗原均不发生交叉反应。对人工感染病例的检测结果表明,建立的双夹心ELISA方法可用于临床快速诊断IBDV。

夹心ELISA定量检测猪圆环病毒2b型抗原方法的建立

为建立快速定量检测猪圆环病毒2b型(PCV2b)抗原含量的方法,本研究采用重组抗PCV2b纳米抗体作为捕获抗体,鼠抗PCV2b单克隆抗体为检测抗体,建立了定量检测PCV2b的夹心ELISA方法。该方法不仅能够用于猪圆环疫苗中PCV2b抗原的检测,还可用于大肠杆菌或杆状病毒表达的PCV2b衣壳蛋白(Cap)亚单位疫苗的检测,且与其它猪病毒无交叉反应。该方法检测细胞培养PCV2b的线性范围是104.3TCID50/mL^105.5TCID50/mL,样品回收率为89.3%~105.6%,该方法批内、批间变异系数小于5%,重复性好。该方法与间接免疫荧光方法(IFA)检测相同样品时误差值小于10%,并且ELISA检测结果离散度更小。分别用两种方法定量PCV2b抗原,取相同抗原量免疫猪,其诱导产生的PCV2b抗体效价无显著差异。本研究构建的夹心ELISA方法在定量猪圆环疫苗中PCV2b抗原方面,与传统的IFA方法比较其显示了良好的符合性,并具有更好的重复性和更短的检测周期,是替代IFA方法用于PCV2b定量检测的更优选择。