粉葛PtERF98基因克隆及表达分析

乙烯响应因子(ethylene responsive factors,ERF)是植物特有的一类转录因子,在乙烯信号转导通路、植物生长发育和逆境胁迫响应中起重要的调控作用。为探明PtERF98转录因子在粉葛(Pueraria thomsonii Benth.)块根采后生理性变质(post-harvest physiological deterioration,PPD)过程中的表达调控机制,本研究采用RT-PCR技术从火山粉葛叶组织中克隆PtERF98基因,并对其进行生物信息学、组织表达特异性分析和在PPD过程中的表达分析。结果显示,PtERF98基因CDS序列长450 bp,编码149个氨基酸残基;PtERF98蛋白理论分子量为16.93 kDa,理论等电点为8.06,为亲水性不稳定蛋白。蛋白结构分析显示,PtERF98具有典型的AP2保守结构域,属于ERF转录因子家族成员,定位于细胞核,无跨膜螺旋结构,含有1个信号肽和16个磷酸化位点。氨基酸序列同源性和系统进化关系分析表明,PtERF98与大豆(Glycine max)GmERF98同源性最高且亲缘关系最近。组织表达分析显示,PtERF98基因在火山粉葛的根、茎、叶中均有表达,且在不同组织中的相对表达量存在差异,叶中表达量最高。此外,PtERF98的表达受到PPD的显著诱导,表达水平随着PPD时间延长呈先升高后下降趋势,并在采后48 h达到最高,推测该基因可能参与粉葛块根的PPD过程。本研究可为深入了解PtERF98基因的功能及其在粉葛PPD过程中的表达调控作用奠定研究基础。

微小RNA-98-5p靶向Kruppel样转录因子9对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用

目的探讨微小RNA(miR)-98-5p靶向Kruppel样转录因子9(KLF9)对大鼠心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤的保护作用。方法50只大鼠随机分为假手术组、模型组、miR-98-5p agomir组、agomir-NC组及miR-98-5p agomir+pcDNA-3.1-KLF9组,每组10只。通过冠状动脉结扎法建立MI/R注模型。HE染色观察心肌组织病理情况;TUNEL检测心肌组织细胞凋亡情况;ELISA检测血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)含量;Real-time PCR检测心肌组织miR-98-5p、KLF9 mRNA表达水平;Western blotting检测心肌组织KLF9、Bax和JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达;双荧光素酶报告实验验证miR-98-5p与KLF9的关系。结果与假手术组相比,模型组大鼠心肌细胞排列较乱,出现坏死;心肌组织细胞凋亡率、血清CK、CK-MB、LDH含量均升高,心肌组织miR-98-5p表达水平下降,KLF9 mRNA和蛋白及p-JAK2和p-STAT3蛋白表达均升高(P<0.05)。过表达miR-98-5p后,大鼠心肌细胞排列较为整齐,心肌细胞坏死减少;心肌组织细胞凋亡率、血清CK、CK-MB、LDH含量及心肌组织p-JAK2、p-STAT3蛋白表达均下降(P<0.05)。双荧光素酶报告实验结果验证KLF9是miR-98-5p的靶基因。过表达KLF9逆转了miR-98-5p agomir对心肌损伤大鼠产生的作用。结论MiR-98-5p靶向KLF9改善MI/R大鼠心肌损伤,其机制可能与miR-98-5p调控JAK2/STAT3信号通路抑制心肌细胞凋亡相关。

血清miR-98-5p、LncRNA XIST在急性呼吸窘迫综合征患儿中与疾病严重程度、预后的关系

目的:检测急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患儿血清中微小RNA(miR)-98-5p、长链非编码RNA(LncRNA)X染色体失活特异性转录因子(XIST)表达情况,并探究二者与疾病严重程度、预后的关系。方法:收集86例ARDS患儿为研究对象(研究组),同期健康体检儿童90名设为对照(对照组),参考柏林(2012年)ARDS病情严重程度诊断标准中动脉血氧分压/吸入氧浓度将ARDS患儿分为轻度组、中度组、重度组;另根据ARDS患儿28 d生存状况分为存活组和死亡组。实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测血清miR-98-5p、LncRNA XIST水平,绘制受试者工作特性(ROC)曲线分析血清中miR-98-5p、LncRNA XIST水平对ARDS患儿预后不良的预测价值;Kaplan-Meier生存曲线分析血清miR-98-5p、LncRNA XIST水平与ARDS患儿预后的关系;Pearson分析ARDS患儿血清中miR-98-5p与LncRNA XIST的相关性。结果:与对照组相比,研究组血清中miR-98-5p水平降低(P<0.01),LncRNA XIST水平升高(P<0.01)。与轻度组相比,中度组、重度组血清中miR-98-5p水平降低(P<0.05),LncRNA XIST水平升高(P<0.05);与中度组相比,重度组血清中miR-98-5p水平降低(P<0.05),LncRNA XIST水平升高(P<0.05)。与存活组相比,死亡组血清中miR-98-5p水平降低(P<0.01),LncRNA XIST水平升高(P<0.01)。ROC曲线显示,血清中miR-98-5p、LncRNA XIST水平预测ARDS患儿预后不良的ROC曲线下面积分别为0.771、0.764,截断值分别为0.54、1.97,其敏感性分别为76.1%、86.9%,特异性分别为73.7%、52.6%;血清中miR-98-5p联合LncRNA XIST预测ARDS患儿预后不良的ROC曲线下面积为0.888,其敏感性为77.6%、特异性为94.7%。miR-98-5p高表达者存活率35.14%高于低表达者12.24%(P<0.05),LncRNA XIST高表达存活率12.73%低于低表达者38.71%(P<0.01)。Pearson分析发现ARDS患儿血清中miR-98-5p与LncRNA XIST呈负相关关系(r=-0.411,P<0.05)。Starbase3.0预测发现LncRNA XIST与miR-98-5p存在结合位点。结论:ARDS患儿血清中miR-98-5p水平降低、LncRNA XIST水平升高,二者均与疾病严重程度、预后关系密切,且二者呈显著负相关,有望用于评估ARDS疾病严重程度、预后。

circBPTF靶向miR-98-5p对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响及其机制

目的 探讨circ溴结构域PDH指转录因子(BPTF)对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响及分子机制。方法 肾小管上皮细胞分为对照组(Con)、高糖组(HG)、HG+si-NC组、HG+si-circBPTF组、HG+miR-NC组、HG+miR-98-5p组、HG+si-circBPTF+anti-miR-NC组、HG+si-circBPTF+anti-miR-98-5p组。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测circBPTF和miR-98-5p表达;流式细胞术检测细胞凋亡;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6水平;双荧光素酶报告实验证实circBPTF和miR-98-5p的靶向关系。结果 与Con组比较,HG组肾小管上皮细胞中circBPTF表达、IL-6、TNF-α水平和凋亡率升高,miR-98-5p表达水平降低(P<0.05)。与HG+si-NC组或HG+miR-NC组比较,HG+si-circBPTF组和HG+miR-98-5p组IL-6,TNF-α水平降低,细胞凋亡率降低(P<0.05)。circBPTF靶向调控miR-98-5p;下调miR-98-5p逆转了抑制circBPTF表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用。结论 抑制circBPTF表达通过靶向上调miR-98-5p对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤起保护作用。

支气管哮喘患儿肺泡灌洗液miR-98-5p及靶蛋白STAT3的表达与气道炎症的相关性分析

目的:探讨支气管哮喘患儿肺泡灌洗液(BALF)中miR-98-5p及靶蛋白STAT3表达水平与气道炎症的相关性。方法:选取2017年1月至2020年5月于重庆市涪陵区妇幼保健院就诊的120例支气管哮喘患儿作为哮喘组,包含72例急性发作期患儿(BA-E组)和48例缓解期患儿(BA-R组);纳入20例无支气管哮喘患儿为对照组。收集BALF,用实时荧光定量PCR法检测其中miR-98-5p相对表达量,采用酶联免疫吸附法检测STAT3和气道炎症因子(IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、总IgE),另外检测哮喘患儿肺功能和FeNO含量。结果:与对照组相比,哮喘患儿BALF中miR-98-5p相对表达量降低,STAT3水平升高,且BA-E组患儿miR-98-5p和STAT3水平变化更明显(P<0.05)。经TargetScan在线软件和双荧光素酶报告基因分析显示,miR-98-5p存在与STAT3 mRNA相结合的互补序列。与BA-R组相比,BA-E组FEV1、FEV1/FVC以及BALF中IL-10水平降低(P<0.001),同时FeNO和BALF中IL-6、IL-13、TNF-α、IgE水平均增高(均P<0.05)。经Pearson分析,哮喘患儿BALF中miR-98-5p与STAT3、IL-6、IL-13、TNF-α、IgE呈负相关(均r<0,P<0.001),与IL-10水平则呈正相关(r=0.288,P=0.001);而STAT3水平与IL-6、IL-13、TNF-α、IgE均呈正相关(均r>0,P<0.001),与IL-10水平则呈负相关(r=-0.285,P<0.001)。结论:支气管哮喘患儿BALF中miR-98-5p相对表达量降低,同时STAT3蛋白水平升高,且两者与气道炎症有关。

miR-98调节IL-6/STAT3通路对肺癌HCC827细胞吉非替尼耐药的影响

目的:探究microRNA-98(miR-98)调节白细胞介素-6/信号传导与转录激活因子3(IL-6/STAT3)通路对肺癌HCC827细胞吉非替尼耐药(GR)的影响。方法:体外培养肺癌HCC827细胞(NC组),采用肝细胞生长因子(HGF)联合吉非替尼反复诱导肺癌HCC827细胞建立吉非替尼耐药HCC827细胞(GR组),转染miR-98 mimics/NC,分别设为mimic组和mimic-NC组,另外将亲本HCC827细胞作为对照组(Con组)。采用噻唑蓝(MTT)试剂盒检测细胞活性,流式细胞仪检查细胞凋亡情况,实时定量PCR(RT-qPCR)检测细胞miR-98、IL-6、STAT3 mRNA表达,免疫印迹(WB)检测细胞IL-6、STAT3蛋白表达。结果:随吉非替尼处理浓度增加,HCC827细胞、HCC827 GR细胞活性依次降低(P<0.05),同一浓度,HCC827 GR细胞活性高于HCC827细胞(P<0.05)。与Con组比较,NC组、mimics-NC组细胞中miR-98水平降低,而mimics组细胞中miR-98水平明显高于Con组、NC组、mimics-NC组(P<0.05);与Con组比较,NC组、mimics-NC组、mimics组细胞中IL-6、STAT3 mRNA及蛋白水平、细胞活性明显升高,而细胞凋亡率明显降低(P<0.05),且mimics组细胞中IL-6、STAT3 mRNA及蛋白水平、细胞活性明显低于NC组、mimics-NC组,而细胞凋亡率明显高于NC组、mimics-NC组(P<0.05)。结论:miR-98过表达可扭转HCC827细胞吉非替尼耐药,其作用机制可能与抑制IL-6/STAT3通路活化有关。

沉默CDKN2B-AS1调控miR-98-5p、STAT3对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的影响

[目的]探讨细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B反义RNA 1(CDKN2B-AS1)是否通过靶向miR-98-5p影响高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤。[方法]将HUVEC分为对照组(含5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养)、模型组(含33.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养)、模型+si-NC组、模型+si-CDKN2B-AS1组、模型+miR-NC组、模型+miR-98-5p模拟物组、模型+si-CDKN2B-AS1+anti-miR-NC组、模型+si-CDKN2B-AS1+anti-miR-98-5p组。运用实时定量聚合酶链反应检测HUVEC的CDKN2B-AS1、miR-98-5p表达;Western blot检测信号转导及转录激活因子3(STAT3)蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)试剂盒检测SOD、LDH、MDA水平。双荧光素酶报告实验分析miR-98-5p与CDKN2B-AS1、STAT3的靶向结合。[结果]高糖使HUVEC中CDKN2B-AS1、STAT3表达、凋亡率、LDH、MDA水平升高,miR-98-5p表达、SOD水平降低(P<0.05)。沉默CDKN2B-AS1或过表达miR-98-5p后,高糖诱导的HUVEC中CDKN2B-AS1、STAT3表达、凋亡率、LDH、MDA水平降低,miR-98-5p表达、SOD水平升高(P<0.05)。双荧光素酶报告实验显示,CDKN2B-AS1靶向miR-98-5p,miR-98-5p靶向STAT3。抑制miR-98-5p逆转了沉默CDKN2B-AS1对高糖诱导的HUVEC凋亡、氧化应激、STAT3蛋白表达的抑制作用。[结论]沉默CDKN2B-AS1通过调节miR-98-5p/STAT3轴抑制高糖诱导的HUVEC氧化应激和凋亡,CDKN2B-AS1可作为糖尿病相关血管并发症的候选治疗靶标。

长链非编码RNA DSCR8在胃癌中的表达及其与预后的关系

目的通过检测长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)唐氏综合征关键区域8(Down syndrome critical region 8,DSCR8)在胃癌患者胃癌组织中的表达情况,对其表达水平与患者预后的关系以及与信号传导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、微小RNA-98-5p(miR-98-5p)的相关性进行探讨。方法选取2013年8月至2015年6月185例我院已确诊收治的胃癌患者手术切除的胃癌组织、癌旁组织标本,采用实时荧光定量PCR方法检测组织样本中DSCR8、Stat3、miR-98-5p的表达情况,对DSCR8与胃癌临床病理参数的关系进行分析;DSCR8与STAT3、miR-98-5p以及STAT3和miR-98-5p间相关性用Pearson相关系数进行分析;采用Kaplan-Meier进行生存曲线分析;胃癌患者预后的影响因素使用Cox生存回归分析方法。结果与癌旁组织相比,胃癌组织中DSCR8的表达水平显著增加(P<0.05);DSCR8表达在患者淋巴结转移、肿瘤大小和TNM分期中差异有统计学意义(P<0.05)。胃癌组织中STAT3的表达水平显著增加,而miR-98-5p的表达水平则显著降低(P<0.05),二者呈显著负相关;DSCR8与STAT3呈显著正相关,而与miR-98-5p呈显著负相关;与DSCR8高表达组相比,DSCR8低表达组预后生存率较高(P<0.05)。多因素分析发现,淋巴结转移、TNM分期、肿瘤大小、DSCR8高表达均是影响预后生存的独立危险因素(P<0.05)。结论胃癌患者胃癌组织中DSCR8呈高表达,且与患者临床病理参数及预后生存情况密切相关,检测其表达水平对判断患者预后生存情况具有重要价值。