新疆玉米普通锈病(Puccinia sorghi Schw)侵染生活史及初侵染源研究

【目的】研究玉米普通锈病在新疆自然的生境条件下,个体发育中各个孢子世代的生物表现型及其初侵染源形式。【方法】采集玉米普通锈病孢子,分析夏孢子和冬孢子存活能力,并将病原菌接种于玉米上观察发病情况。【结果】菌初侵染时期和整个夏季所生成夏孢子堆的生物特性,只是为病原在寄生生活周期内营扩大再侵染的繁殖用。夏孢子的萌发和侵染的适宜温度为10.829℃,最适温度为14.922.4℃,温度在10℃以下萌发终止。玉米收割后,夏孢子在寄主基质上可残生时间约在55 d以内,至11月26日检验其活性时,发现许多夏孢子体内的颗粒体已消耗殆尽,形成透明的空腔,有的则失去光泽,呈现淡灰褐色,丧失了发芽能力,鉴此看出该病夏孢子抗逆性很差,不能逾越新疆漫长严酷的寒冬。研究还发现,临秋时节,玉米病体上出现一种深锈褐色的休眠夏孢子堆的菌态,此菌态有强劲抗逆性的特异功能,在持续2个多月零下2024℃的寒冬期后,仍具有正常的萌发力和对寄主侵染的致病毒性。【结论】在新疆的冬季,玉米普通锈病是以休眠夏孢子堆作为越冬世代,而且是玉米在生产中感染锈病唯一的初次感染源。该病冬孢子世代在新疆的侵染生活史上并无实质性的病理学意义。

向日葵品种对锈病抗性的组织学和超微结构研究

为了进一步了解向日葵与向日葵锈病病菌的互作关系及品种的抗性机制,采用电子显微镜技术对向日葵品种对锈病抗性的组织学和超微结构进行研究。在电镜下观察发现,向日葵锈病菌侵染向日葵后,在感病品种和抗病品种上发育的组织学和超微结构特征有明显差异。病菌在感病品种细胞间隙分布有大量的胞间菌丝,寄主细胞发生质壁分离;叶绿体变形,叶绿体的片层结构排列零乱,直至叶绿体解体。在抗病品种上表现为菌丝生长受抑,没有观察到吸器的产生,寄主细胞的早期坏死与锈菌的发育受阻密切相关。品种的抗病性可能与饥饿阻止真菌生长有关。

向日葵锈菌侵染过程的超微结构研究

采用电子显微镜技术对向日葵锈菌的侵入和扩展过程进行了研究,结果表明,向日葵锈菌夏孢子萌发产生1个芽管,遇到合适结构的气孔后,在气孔上方形成附着胞从气孔侵入,胞间菌丝与叶肉细胞壁接触后分化出吸器母细胞,吸器母细胞进入叶肉细胞内部形成吸器。胞间菌丝在吸器母细胞处分化出次生菌丝,在叶肉细胞间扩展,病菌菌丝多在寄主细胞间隙或沿寄主细胞壁延伸。在病原菌侵染早期,寄主细胞的超微结构变化并不明显;侵染中、后期,被侵染叶肉细胞发生质壁分离,叶绿体膨胀变形,细胞器解体,细胞崩解。

向日葵锈菌转录组SNP位点挖掘及所在基因功能注释

为了解向日葵锈菌基因组中SNP所在基因功能及其致病性,使用SOAPsnp软件对向日葵锈菌330小种不同萌发阶段(0,4,8 h)的转录组测序结果拼接得到的59 409条Unigene序列进行SNP检测,计算其发生频率并对其进行Nr、Nt注释、GO分类、COG分类、KEGG代谢通路注释与PHI比对。结果发现,共有29 966个SNP位点分别分布在8 321条Unigene上,SNP发生的频率为1/2 764 bp,其中转换19 599个,颠换10 367个。在所有变异类型中,A/G和C/T发生频率最高,分别达32.80%和32.60%。注释结果表明,分别有79.46%,43.00%的序列被注释到Nr、Nt数据库中,基因中涉及最多的为遗传信息过程通路,以翻译为主;最后将这些含SNP Unigene与病原菌寄主互作数据库PHI比对,共筛选到961条可能与向日葵锈菌致病性相关的含SNP的序列,因而认为,锈菌的致病性是由真菌细胞壁修饰蛋白和潜在的致病效应蛋白所致。结果可为以后进一步开发SNP遗传多态性、遗传图谱的构建提供理论依据,为研究向日葵锈菌毒力与功能奠定基础,并对向日葵的抗病育种研究具有重大意义。

向日葵锈菌夏孢子转录组微卫星特征分析

为大规模开发有效的向日葵锈菌SSR标记,根据向日葵锈菌转录组数据,使用Ubuntu 12.04 LTS系统的Perl操作平台MISA软件对向日葵锈菌转录组序列进行高通量微卫星SSR位点发掘。在15 946条转录本中发现20 861个SSR,平均3.97kb出现一个SSR。共发现244种碱基重复模式,(A/T)n所占比例最高,达到88.24%。在42 610条注释成功的向日葵锈菌unigene中,含有SSR的序列14 069条,共发现18 100个SSR位点,其中位于编码区1 057个,出现频率为0.382 2 SSR/kb,非编码区为0.300 1 SSR/kb;其中以单核苷重复基序为主导,共有19 046条,占总SSR的59.5%;其次是三碱基微卫星(804,占3.86%)。大部分微卫星长度小于20bp,长度大于20bp的仅占7.37%。研究结果显示,微卫星与基因平均表达水平存在关联,含微卫星基因的平均表达水平低于不含微卫星基因的平均表达水平。包含SSR的15 946条unigene中只有5 863个unigene获得了GO分类号,被注释到分子功能、生物进程、细胞组分三大本体。通过生物信息学软件得到的转录组SSR标记位点可用于后续向日葵锈菌遗传多样性研究,而且对其他非模式生物或新物种SSR标记开发也具有重要的参考作用。

寡糖诱导向日葵抗锈病的信号转导途径

为了解寡糖诱导向日葵抗锈病过程中的信号转导途径,利用寡糖、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)预先喷雾处理向日葵叶片,1d后接种锈菌,通过对植株体内脂氧合酶(LOX)活性及SA含量的测定,并通过RT-PCR对SA、JA信号途径的标记基因PR5和PDF1.2等表达水平进行测定,初步确定诱导抗性表达的信号转导途径。结果表明:经寡糖诱导后,向日葵叶片内LOX活性降低,SA含量上升,且诱导水杨酸途径标记基因PR5表达量增加。结果说明寡糖诱导向日葵抵抗锈病主要与SA介导的信号途径有关。

不同抗性的向日葵品种接种锈菌后叶片中可溶性蛋白、可溶性总糖及叶绿素含量的变化

通过对两个不同抗性向日葵品种在苗期接种向日葵锈菌,测定了接种后不同时间叶片的可溶性总糖、可溶性蛋白及叶绿素含量的变化.研究结果表明:抗病品种的可溶性总糖比感病品种高;可溶性蛋白质含量、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量的变化与向日葵抗病性有密切关系,而和叶绿素a含量的变化与抗病性没有直接关系.

向日葵叶片保护酶系的活性与品种抗锈病性的关系

为了了解不同抗性的向日葵品种与锈菌(Puccinia helianthi)互作后保护酶系代谢的变化与向日葵抗锈病性的关系,接种锈菌后不同时间测定了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性变化,测定结果表明:抗病品种这5种酶活性升高幅度均高于感病品种,说明这5种酶活性的变化与向日葵抗锈病性有密切关系。

内蒙古7种向日葵品种苗期抗锈病性的鉴定

本试验用室内幼苗接种的方法,对内蒙古地区栽培的的7个向日葵品种进行抗锈病性的鉴定,结果表明:益民大白花葵、迪卡.杂交油葵、S40(Hyole ic40)油葵、S31(HySun33)油葵呈抗锈病反应型;益民星火花葵、益民大青花葵、益民花葵二号呈感锈病反应型。其中益民花葵二号最感病,S31(HySun33)油葵最抗病。

寡糖诱导向日葵抗锈病最佳浓度及时间筛选

向日葵锈病(Puccinia henlianthi Schw.)是向日葵的主要病害,危害日益严重。利用诱导剂激活植物的抗病防卫反应,是防治植物病害的一种很好的途径。通过用寡糖诱导处理向日葵幼苗,对接种锈菌的幼苗病情指数与相对防效的测定,筛选寡糖最佳诱导浓度及最佳诱导时间。结果表明:100倍浓度寡糖诱导有较好的防效;寡糖诱导向日葵的最佳时间在接菌前1～2 d,2 d效果最佳。

向日葵抗锈病基因同源序列的克隆与分析

向日葵锈病严重影响向日葵的产量。为了找到抗锈病相关基因，根据已知NBS-LRR型抗病基因保守结构域P-loop和GLPL设计简并引物，以接菌的抗病向日葵品种CM29叶片的cDNA为模板进行扩增。通过克隆转化得到10个具有连续开放阅读框的抗病基因同源序列（RGA），经系统进化分析将其分为TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR两种类型。对其氨基酸序列进行多重序列比对，结果显示所获得的RGA具有典型的NBS-LRR型抗病基因保守结构域，即P-loop、kinase-2a、kinase-3a和GLPL结构。运用BLASTX分析这些结果，表明其RGA与已知的抗病基因相应保守区域的同源性为18．1％～51．1％，说明它们可能与抗病功能基因具有密切联系。

向日葵锈菌弹性金属蛋白酶基因克隆及生物信息学分析

为了研究向日葵锈病的致病机制,将向日葵锈菌转录组中表达量较高的一个基因(KU994904)中成熟部分进行生物信息学分析及基因克隆。利用Interpro对蛋白ORF区域进行分析,确定其成熟区域,通过生物信息学相关软件对其进行结构预测及预测分析,从向日葵锈菌中提取总RNA,并利用RT-PCR方法扩增此蛋白酶成熟基因并克隆。结果显示:该蛋白酶成熟基因序列全长1335bp,编码445个氨基酸,分子质量49.5ku,其与M36家族中5条序列具有较高相似性,并发现同胞外金属蛋白酶基因序列相似度达到53.77%。因此,推断其为弹性金属蛋白酶。

寡糖对向日葵锈菌侵染的影响

为了明确寡糖对向日葵锈菌侵染的影响,在向日葵苗期用寡糖处理,观察接菌后锈菌夏孢子的萌发率和侵入率以及向日葵叶片的气孔开闭,并用甲苯胺蓝染色法对入侵位点酚类化合物的积累进行了检测。试验结果表明,与对照相比寡糖处理后锈菌夏孢子的萌发率和侵入率显著降低,而气孔关闭率显著升高。同时,在接种后12h时,大量的侵入位点产生了酚类化合物的积累,说明寡糖处理可以有效抑制向日葵锈菌的侵染。

向日葵锈病防治药剂的室内筛选

为了筛选防治向日葵锈病的有效杀菌剂,选用15种药剂处理夏孢子进行室内毒力测定试验。结果表明,向日葵锈菌夏孢子对20%二氯异氰尿酸钠可湿性粉剂(WP)最为敏感,有效成分EC50值为4.959 1μg/m L;其次为10%苯醚甲环唑水分散粒剂(WG)、40%氟硅唑乳油(EC)。为了明确其最佳施药时期,在温室条件下通过先接菌后施药和先施药后接菌的方法,测试了15种药剂对向日葵锈病的防治效果。结果表明,在15种药剂中,80%戊唑醇(WG)、25%嘧菌酯悬浮剂(SC)和20%二氯异氰尿酸钠(WP)3种不论是接种前喷药还是接菌后施药,对向日葵锈病的防治效果均达到100%,可以作为田间向日葵锈病防治的首选药剂。75%百菌清(WP)及77%硫酸钙铜(WP)作为治疗剂防效较差,但仍可用于病害预防。

向日葵锈菌夏孢子萌发条件的研究

以向日葵锈菌330生理小种为材料,研究了夏孢子萌发的适宜条件和培养载体。向日葵锈菌夏孢子萌发适宜温度范围10~25℃,最适温度15℃。15℃下在琼脂薄膜上1h即可萌发,12h达到萌发高峰,萌发率最高可达97%。孢子在无菌水中萌发最适浓度为20mg/L,萌发率随浓度增大而降低。光照在前5h均抑制夏孢子萌发,但7h后光照对夏孢子总萌发率基本无影响。新鲜夏孢子萌发率较高,在室温放置270d后基本丧失萌发能力。最适条件下,在供试的6种不同萌发载体上,夏孢子萌发率、芽管长度及萌发形态显著不同,琼脂薄膜载玻片、尼龙纱网、玻璃纸较适宜夏孢子萌发,萌发率超过90%;在PVDF膜和亲水滤膜上可观测到芽管内部黄色物质转移和特殊结构的形成。

向日葵柄锈菌效应蛋白的预测及筛选

向日葵柄锈菌(Puccinia helianthi Schw.)引发向日葵锈病,对生产具有破坏性。为深入了解锈菌效应蛋白,研究病原与寄主的互作机理,在获得向日葵柄锈菌分泌蛋白组的基础上,利用生物信息学软件预测及分析向日葵柄锈菌效应蛋白,采用qRT-PCR检测其中7个候选效应蛋白基因在接种叶片中的相对表达量。结果表明:在供试的900个锈菌的分泌蛋白中预测到候选效应蛋白497个。基因特征分析显示,开放阅读框长度在200~399 bp之间的最多;信号肽长度集中在16~27个氨基酸残基(占92.96%);信号肽氨基酸组成中亮氨酸出现频率最高,其次为丙氨酸、异亮氨酸;信号肽识别位点以SpⅠ型为主。本研究获得了7个向日葵柄锈菌的效应蛋白,qRT-PCR检测表明柄锈菌接种向日葵叶片后,与纯孢子相比,这7个效应蛋白编码基因均上调表达,说明其参与了锈菌侵染向日葵的过程。

向日葵锈病抗性相关microRNA的挖掘及其靶基因预测

前期利用高通量测序技术及生物信息学分析方法,在向日葵上预测筛选到10个差异表达的新microRNA(miRNA)可能与锈病抗性相关。本试验利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,对筛选到的10个miRNA做进一步的定量验证。结果表明,相比于水处理的健康叶片(对照组A),接种锈菌300生理小种的叶片中(抗病组B)HanmiR21、Han-miR25、Han-miR42表达量呈上调趋势,Han-miR11、Han-miR34、Han-miR43、Han-miR47、Han-miR67表达量呈下调趋势;接种锈菌737生理小种的叶片中(感病组C)Han-miR25、Han-miR42的表达量呈上调趋势,Han-miR11、Han-miR21、Han-miR34、Han-miR43、Han-miR47、Han-miR67表达量呈下调趋势。qRT-PCR的检测结果与前期高通量测序结果 80%相一致。利用miRanda软件预测靶基因,10个miRNA共预测到117个靶基因,其中86个靶基因获得其生物信息学功能注释。运用miRBase数据库,对10个新预测miRNA进行同源性分析发现,新预测的10个miRNA与拟南芥、烟草、水稻等作物中参与病害逆境胁迫响应的miRNA有较高相似性(62%~100%)。定量检测和验证miRNA作用的靶基因时发现,抗病组表达量上调的Han-miR21对应的靶基因有1个下调、表达量下调的Han-miR43对应的靶基因有3个上调,符合miRNA与其靶基因互作的规律。

9种植物源杀菌剂对向日葵锈病的防效分析

本研究收集了9种商品植物源杀菌剂进行了室内毒力测定、施药适期及粘附性试验,以期筛选出防治向日葵锈病的高效植物源杀菌剂。结果表明,在毒力测定试验中,0.3%丁子香酚(可溶液剂,SL)对向日葵锈菌夏孢子毒力最强,EC_(50)值为1.58 mg/L,其次为0.4%蛇床子素(SL)和80%大蒜油(乳油,EC),EC_(50)值分别为3.43 mg/L和5.154 mg/L;在施药适期试验中,采用了先接菌后喷药和先喷药后接菌两种方法,0.3%丁子香酚(SL)防治效果均为最好,分别为86.42%和88.79%,其次为0.4%蛇床子素(SL)和80%大蒜油(EC),防治效果均达到70%以上,与其它杀菌剂存在显著差异;在粘附性试验中,喷施0.3%丁子香酚(SL)锈菌孢子的粘附率最小,为73%,显著低于对照,其次为0.4%蛇床子素(SL)和80%大蒜油(EC),粘附率分别为76%和80%。综合三种试验结果表明,0.3%丁子香酚为防治向日葵锈病的首选植物源杀菌剂,其次可选用0.4%蛇床子素(SL)和80%大蒜油(EC)。

向日葵锈菌胞外金属蛋白酶的特性分析

为进一步了解锈菌侵染向日葵的致病机制,对向日葵锈菌(Puccinia helianthi)分泌的一种新型的金属蛋白酶(metalloproteinase,Mep)水解活性和生物学特性进行了表征。使用偶氮酪蛋白法测定蛋白酶的活性,在波长280 nm下测吸光度。结果表明,该蛋白酶对偶氮酪蛋白具有水解活性,纯酶最适温度和pH分别是50℃和7.0,在pH 5.0~9.0和温度50℃以下保持稳定。蛋白酶受到抑制剂乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、1,10-菲咯啉的显著抑制;Ca^(2+)、Zn^(2+)、Mg^(2+)可以显著提高该蛋白酶的活性,表明该酶为金属蛋白酶。另外,利用qRT-PCR试验测定了基因Mep在锈菌侵染向日葵的过程中的表达情况,结果显示,在接菌48 h时,基因表达量达到高峰,后逐渐降低,表明该蛋白酶参与了锈菌对向日葵的早期侵染过程。

辽宁省玉米锈病病原菌鉴定及其生物学研究

根据玉米锈病田间症状和病原菌形态,鉴定确认辽宁省玉米锈病是由玉米柄锈菌(Pucciniasorghi Schw.)所致。病原菌生物学研究结果表明,夏孢子萌发温度为5℃～35℃,最适温度为25℃;最适湿度为100%;萌发pH为4～10,最适pH值为7。供试碳源对夏孢子萌发均有不同程度促进作用,最适碳源为蔗糖。供试氮源对夏孢子萌发有抑制作用,酪氨酸的抑制作用最大。夏孢子致死温度为47℃、10min;冬孢子致死温度为49℃、10min。冬孢子室内常温下越冬最多存活75d。