Optimization of Pulsed-field Gel Electrophoresis Procedure for Bacillus cereus

In order to develop a rapid and reliable method for B. cereus genotyping, factors influencing PFGE results, including preparation of bacterial cells embedded in agarose, lysis of embedded cells, enzymatic digestion of intact genomic DNA, and electrophoresis parameters allowing for reproducible and meaningful DNA fragment separation, were controlled. Optimal cellular growth （Luria-Bertani agar plates for 12-18 h） and lysis conditions （4 h incubation with 500 μg/mL lysozyme） produced sharp bands on the gel.

福建省嗜肺军团菌血清1型及血清6型菌株PFGE分型研究

目的研究福建省2008年至2010年公共场所空调冷却塔水及冷凝水中分离的嗜肺军团菌血清Ⅰ型(LP1)及血清Ⅵ型(LP6)的基因特征。方法应用脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)技术对57株LP1型军团菌及15株LP6军团菌进行电泳,并用BioNumerics(version 6.0,Applied Maths,Inc)软件包对其进行聚类分析。结果 57株LP1军团菌可分为40种PFGE型,菌株间相似性系数在24.107%～100.000%之间不等,大部分菌株的PFGE型别差异明显,无优势型别。不同地区分离的LP1军团菌既有差异较大的带型,也存在相同和相似的带型;相同地区,菌株间相似性系数存在差异,无优势菌株。15株LP6军团菌可分为12个不同的PFGE型别,菌株间相似性系数在27.87%～100.00%之间。结论 2008-2010年福建省公共场所空调冷却塔水及冷凝水中分离的LP1及LP6军团菌呈现基因多样性。

嗜肺军团菌SBT、PFGE、AFLP分子分型方法的比较

比较SBT、PFGE、AFLP三种分子分型方法在嗜肺军团菌分型研究中的分辨力,探讨SBT方法在嗜肺军团菌分型中的可应用性。收集石家庄市6所医院冷却塔水中分离的32株嗜肺军团菌,对其中的24株血清I型嗜肺军团菌进行SBT分型研究,并与PFGE和AFLP分型结果进行了比较。24株LP1型嗜肺军团菌共分为4个ST型,分辨系数为0.239 1。PFGE方法将32株菌株共分为15个PFGE型,分辨系数为0.925 4。AFLP方法将32株菌株分为23个AFLP型,分辨系数为0.973 7。通过比对EWGLI网站SBT数据库,ST1021型和ST345型为本地区独特型别且属于同一克隆系;ST1型为优势型别并在我国长期流行;由于缺失neuA而未分型的嗜肺军团菌株与其他23株菌分属于不同的克隆系。SBT方法的分型能力不及PFGE方法和AFLP方法。但SBT分型方法能够通过全球比对数据库得到更多的关于菌株遗传进化和流行分布的资料,在研究菌株分子流行病学及进化方面优于PFGE和AFLP方法。

院内多重耐药鲍曼不动杆菌分子流行病学和耐药性研究

目的分析院内临床和环境多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)的耐药机制和分子流行病学特征,为预防和控制MDRAB的传播提供依据。方法收集2020年5月至2021年4月院内临床及环境分离到的非重复MDRAB菌株34株,其中临床标本25株,环境标本9株。应用PCR和测序方法检测MDRAB的耐药基因。多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对MDRAB进行分子分型。结果34株MDRAB阳性基因携带率分别为:blaOXA23、blaOXA-51及blaOXA64gp均为100%,TEM 85.3%(29/34)。25株临床MDRAB监测到7个ST序列类型:分别为ST540(10/25)、ST195(5/25)、ST369(3/25)、ST208(2/25)、ST381(2/25)、ST938(2/25)和ST451(1/25);6个克隆群:分别为A群(9/25)、D群(8/25)、C群(4/25)、F群(2/25)、E群(1/25)、G群(1/25)。9株环境MDRAB监测到2个ST序列类型:ST208(8/9)、ST540(1/9);2个克隆群:B群(8/9)、C群(1/9)。结论院内MDRAB主要来源于重症监护病房,blaOXA-51-Like+blaOXA-23+blaTEM-like是主要碳青霉烯耐药模式。院内临床流行的主要序列类型为ST540和ST195,主要的克隆群为A群、D群。ST540、A克隆群MDRAB贯穿整个研究阶段且在多个重症监护病区播散流行。临床与环境MDRAB主要流行的ST序列型和克隆群存在差异。

南通市沙门菌PFGE分型分析及数据库的建立

目的:建立南通市沙门菌PFGE分型数据库,研究菌株间的同源关系,以便在发生沙门菌病时快速溯源,为控制该病的传播提供技术支撑。方法:从南通市分离到的5种52株沙门菌中提取DNA,用限制性内切酶XbaI进行酶切,在脉冲场凝胶电泳仪上进行DNA分子分型,应用沙门菌H9812作为PFGE的分子量标准。使用BioNumerics(Version4.0)分析软件,计算实验菌株相互之间的相似性关系。结果:52株沙门菌被分成4个PFGE型,分别命名为NTSpp1～4型,所有的埃森沙门菌、阿贡纳沙门菌、都柏林沙门菌都分别只有一个型,而德尔卑沙门菌则有4个型。菌株的来源(人和食品)不影响细菌的PFGE分型。NTSpp1和NTSpp2之间以及NTSpp3和NTSpp4之间的相似性分别为66%和74%,而NTSpp1和NTSpp2形成的簇和NTSpp3和NTSpp4之间形成的簇二者之间的相似性为63%。结论:南通市主要沙门菌的PFGE型别较多,呈现多样性。

我国不同地区鸡源致病性大肠杆菌分离株的PFGE分子分型

为了解我国鸡源致病性大肠杆菌的分子流行病学状况,利用PFGE分子分型方法,对2017年分离自山东、吉林、新疆、西藏等7个代表性区域的130株大肠杆菌分离株进行了分子分型研究。结果显示:130株大肠杆菌共分为105个带型,其中33株菌株的图谱相似度在90%以上;不同来源菌株的PFGE带型差别较明显,即使是相同来源菌株,PFGE带型差异同样显著,显示了分离株菌株的遗传多样性。本研究为指导我国鸡群大肠杆菌病防控以及鸡源致病性大肠杆菌引发疾病或食品安全突发事件的追踪溯源提供了依据。

布鲁氏菌PFGE分子分型的条件优化

[目的]将PFGE方法应用于布鲁氏菌分型研究,探索建立布鲁氏菌PFGE分型的最优化方法。[方法]在用PFGE方法进行布鲁氏菌基因分型的研究中,针对不同内切酶、酶切的浓度和时间、脉冲时间等影响PFGE分型结果的因素进行优化,利用优化后的条件对布鲁氏菌19株标准菌株进行分型研究。[结果]在布鲁氏菌的PFGE分型研究中,选择XbaI为内切酶、酶切浓度为96u/200μl、酶切时间为4h、脉冲时间为2～25s为PFGE电泳的优化条件,在分析的19株布鲁氏菌标准菌株中,6种布菌的PFGE图谱各不相同,但PFGE不能将种内不同生物型布菌完全区分开来。[结论]PFGE方法可用于布鲁氏菌的基因分型的研究,是对传统分型方法一种较好的补充。

2017年扬州市广陵区食品和公共场所从业人员沙门菌血清学及PFGE分型研究

目的探讨扬州市广陵区食品和公共场所从业人员沙门菌感染情况与血清型和分子分型特征。方法2017年采集食品和公共卫生服务行业从业人员肛拭子标本,进行肠道致病菌的分离培养,对分离株进行血清学分型,再以脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子分型和聚类分析。结果2017年共采集肛拭子标本22522份,检出沙门菌34株,检出率0.15%;男性0.10%,女性0.18%,差异无统计学意义(χ^2=2.15,P=0.14);夏秋季检出率(0.24%)高于冬春季(0.021%),差异有统计学意义(χ^2=16.9,P<0.01)。分离株以C1群最多(占35.29%),其次为B群(占32.35%);以里森沙门菌(占17.64%)和鼠伤寒沙门菌(占11.76%)为优势株。将血清凝集能分型的33株沙门菌进行PFGE分型分析,检出30个型别(P1~P30),其中3株为P29型、2株为P30型,上述5株相似度为85.42%,具有高度同源性;分离出的6株里森沙门菌中5株相似度相似度为60.56%,B群中的2株和E4群中的1株相似度为64.85%、C1群中的2株相似度为69.70%,均为相似菌株;其余型别相似度<50%,为流行病学不相关。结论2017年扬州市广陵区食品从业人员沙门氏血清型以C1群和B群为主。优势株为里森沙门菌、鼠伤寒沙门菌。菌株PFGE带型较分散。

广东省伤寒沙门菌株的脉冲场凝胶电泳分型研究

目的运用脉冲场凝胶(PFGE)电泳研究广东省伤寒沙门菌的分子流行病学。方法用PFGE对菌株进行分子分型,所得结果用Bionumerisc V4．0软件进行聚类分析。结果来自广东省6个地区的51株伤寒沙门菌,根据电泳图谱分析,可分为45个PFGE型别,菌株间的相似值在38．27％～100．00％,6个地区间没有同源的菌株,同一个地区不同年份也没有同源的菌株,而同一地区同一年份可出现同源的菌株。结论PFGE是一种敏感的研究伤寒沙门菌分子流行病学的基因分型方法。

2008-2018年北京市伤寒、副伤寒沙门菌病原学特征

目的了解北京市伤寒、副伤寒沙门菌流行特征、耐药及分子分型特点,为伤寒、副伤寒防制工作提供依据。方法通过对2008-2018年北京市肠道门诊监测系统收集到的65株伤寒、副伤寒沙门菌,采用最小抑菌浓度(minimal inhibition concentration,MIC)法进行16种抗生素药敏试验;采用脉冲场凝胶电泳PFGE方法进行分子分型研究。结果 65株菌包含4种血清型:伤寒沙门菌24株,占36.9%,甲型副伤寒沙门菌7株,占10.8%,乙型副伤寒沙门菌20株,占30.8%,丙型副伤寒沙门菌14株,占21.5%。随着年代的推移,会出现血清型的交替变迁,2013年以后,以伤寒和乙型副伤寒沙门菌为主。高发年龄组为0～10岁组和31～40岁年龄组。65株菌对阿莫西林-克拉维酸、强力霉素、阿奇霉素和亚胺培南4种抗生素全部敏感,对其他12种抗生素有不同程度的耐药。对磺胺异噁唑、萘啶酸、链霉素和氨苄西林等经典抗生素的耐药性有上升趋势,对头孢菌素和三代氟喹诺酮类环丙沙星不同血清型间耐药性存在差异,多重耐药率为10.8%(7/65)。58株伤寒、副伤寒沙门菌分成34种PFGE型别,带型分散。除2018年一起输入性伤寒暴发识别出9株菌为同一带型,其余每种带型菌株数1～3株不等,相似度为32.2%～100.0%。结论 2008-2018年,北京市伤寒、副伤寒沙门菌维持在较低水平,血清型正逐步转变成以伤寒和乙型副伤寒为主。不同血清型间抗生素耐药程度不同,临床应合理用药。PFGE型别多样,未出现优势克隆群。

副溶血性弧菌引起食物中毒的同源性研究

目的:探讨深圳市龙岗区由副溶血性弧菌O3:K6型引起食物中毒的分子流行病学研究和同源性分析。方法:收集不同地区、不同时期食物中毒事件的副溶血性弧菌菌株,并从7宗相同血清型O3:K6的溶血性弧菌菌株中,每宗取1株副溶血性弧菌进行生化鉴定、血清学分型、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析。结果:7株副溶血性弧菌,它们的血清型均为O3:K6,脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析结果显示,有2株副溶血性弧菌图谱一致,具有高度的同源性;5株副溶血性弧菌为紧密相关。结论:通过PFGE分子分型的方法了解到该血清型O3:K6的副溶血性弧菌菌株之间具有紧密相关和高度的同源性,表明副溶血性弧菌血清型O3:K6是该地区引起腹泻的主要菌型。

浙江省引起暴发的宋内志贺菌的耐药性及分子分型研究(2006)

目的:了解引起浙江省菌痢暴发的宋内志贺菌耐药性及分子分型情况,为流行病学溯源及合理有效使用抗生素提供依据。方法:77株志贺菌均按GB16002-1995标准进行鉴定分型,并采用Kirby-Bauer法检测其对14种抗生素的敏感性,并采用WHONET5.3软件,对菌株的耐药性进行分析。同时,通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对菌株进行分子分型,通过同源性分析以确定菌株间的亲缘关系。结果:77株宋内志贺菌对氨苄西林、利福平的耐药率最高,达100.0%,其次是红霉素98.7%;对诺氟沙星、环丙沙星最敏感,其敏感性高达98.7%。脉冲场凝胶电泳分型77株试验菌株共分为3个PFGE基因型,1型16株占20.8%,庆元、苍南菌痢暴发可能源于同一宋内志贺菌克隆系;2型34株占44.2%,常山、龙湾菌痢暴发可能源于同一宋内志贺菌克隆系;3型27株,均分离自江山,占35.0%。结论:宋内志贺菌是2006年引起浙江省菌痢暴发的主要菌型,多重耐药现象严重,基因型间差异较小,抗生素型与基因型间无明确关系。

乳酸杆菌脉冲场凝胶电泳分子分型的条件优化

目的:通过将脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法应用于乳酸杆菌分型研究,以建立乳酸杆菌PFGE分型的最优方法。方法:针对不同内切酶、酶切浓度、酶切时间、脉冲时间等影响PFGE分型结果的重要因素进行优化,使用优化后的条件对乳酸杆菌22株标准菌株进行分型研究。结果:在乳酸杆菌的PFGE分型研究中,选择AscI为内切酶、酶切浓度为30U/150μL、酶切时间为4.5h、脉冲时间为1～15s为PFGE电泳的最优条件,在所分析的22株乳酸杆菌标准菌株中,5种乳酸杆菌的PFGE图谱各不相同,但种内不同株电泳图谱的区别并不稳定。结论:PFGE方法可用于乳酸杆菌的基因分型研究。

用脉冲场凝胶电泳方法对O139霍乱弧菌分型的研究

目的:利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术探讨O139群霍乱弧菌的分子分型方法。方法:用SfiⅠ酶和NotⅠ酶切O139群霍乱弧菌染色体DNA,经脉冲场凝胶电泳进行片段分离。结果:14株O139群霍乱弧菌经SfiⅠ酶切后电泳分离可得一个PFGE型,用NotⅠ酶切电泳可分为2个PFGE型。结论:脉冲场凝胶电泳技术分析O139群霍乱弧菌,分型发现微小差别有助于分析追踪疫情和来源。

脉冲场凝胶电泳技术在鼠伤寒沙门菌分型中的应用

[目的]探讨脉冲场凝胶电泳(PFGE)在鼠伤寒沙门菌分型中的应用。[方法]选择XbaⅠ酶对鼠伤寒沙门菌全基因组DNA进行酶切、脉冲场凝胶电泳,电泳带用Freeview软件进行相似性比较。[结果]13株鼠伤寒沙门菌经PF GE,根据其条带的差异可分为10个PFGE型别。[结论]PFGE法重复实验结果稳定,分型力较强,适合鼠伤寒沙门菌分型应用。

伤寒沙门菌的脉冲场凝胶电泳分型方法研究

目的:运用脉冲场凝胶电泳研究宁波市伤寒沙门菌的分子流行病学。方法:选择XbaⅠ酶对伤寒沙门菌染色体DNA进行酶切,采用脉冲场凝胶电泳技术分析电泳酶切指纹图谱,了解其流行状况。结果:14株伤寒沙门菌,根据电泳图谱分析,可分为3个带型。结论:PFGE具有分辨力高,重复性好的特点,是研究伤寒沙门菌分子流行病学较好的基因分型方法。

脉冲场凝胶电泳分型技术应用于宋内志贺菌溯源分析

目的:分析四川省成都市2006年崇州、大邑两地相继暴发的宋内志贺菌食源性感染疫情中病人分离菌株之间,及其环境分离菌株之间的分子分型特征和遗传相关性,推断传染来源。方法:收集两地疫情暴发期间分离的宋内志贺菌株,用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对菌株进行分子分型,所得结果用BioNumerics V4.0软件UPGMA方法进行聚类分析。结果:共测试56株菌,用XbaⅠ酶切后PFGE可分为14个带型。其中崇州菌株38株,有26株带型完全相同(包括1株环境株);有37株菌分布于5种带型,其相似性在97%以上。大邑菌株18株,有10株带型完全相同;其余8株有7种带型,相似性较差。两地之间菌株分子分型差异明显,其相似性小于92%。结论:确证崇州、大邑两地确有宋内志贺菌食源性感染疫情的暴发,但两地之间无交叉传染关系;提示崇州的宋内志贺菌疫情是由食物凉拌菜引起;提示大邑本地有较高的宋内志贺菌流行水平和复杂的传染源。

嗜肺军团菌基因检测及分子特征研究

目的:了解外环境水中分离的嗜肺军团菌菌株的基因特征及遗传背景。方法:40株分离株分别经血清学凝集试验、胶乳凝集试验确定为LP1型嗜肺军团菌后,利用普通PCR技术对军团菌属5S rRNA基因和嗜肺军团菌mip毒力基因的特异序列进行扩增,应用实时荧光定量PCR技术扩增嗜肺军团菌mip基因,使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型技术对菌株进行全染色体DNA酶切电泳分型,并用BioNumerics Version 4.0软件进行聚类分析。结果:所有的菌株均带有属特异性5S rRNA基因及mip毒力基因,PFGE聚类分析结果显示大多数菌株的遗传相似度有一定差异。结论:所有菌株经普通PCR或定量PCR均相应扩增出其特征基因,PFGE聚类分析结果提示浙江省散在水系中分离的嗜肺军团菌菌株存在遗传多样性。

脉冲场电凝胶技术在肠道致病菌分子流行病学调查中的应用研究

目的:探讨建立快速敏感的肠道病原菌的诊断分型方法,有效地追踪溯源和控制传染源。方法:用脉冲场电泳胶与噬菌体分型实验方法对29株S.sonnei分离株与12株EHEC O157∶H7菌株进行分型。结果:4起S.sonnei暴发事件的PFGE的试验结果显示,同起事件的DNA条带几乎一致;2起EHEC O157∶H7暴发事件中,同起事件的PFGE条纹几乎一致,而3株散发菌株的PFGE条纹各异;另外对12株EHEC O157∶H7进行噬菌体分型试验,也显示了比较好的分型力。结论:PFGE具分型力强、重复性高等特点,能直观地判断肠道致病菌的亲缘关系,及时查明暴发流行的传染源,从而有效地控制疫情的蔓延。

应用脉冲场凝胶电泳分型技术对江西省伤寒菌株的分析

目的分析江西省1986年以来伤寒爆发疫情菌株的分子分型特征。方法对所收集的伤寒沙门菌株利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术进行菌株的分子分型。结果40株伤寒菌株分离自1986、1987、2000和2003年的伤寒患者和带菌者,利用PFGE可分为16个型。不同年份、不同地点爆发的伤寒菌株带型不同,同一年份同一地点爆发的伤寒菌株带型也有差异。结论基于PFGE的分子分型能很好地应用于菌株特征的分析,伤寒杆菌在不同年份变异较大。常规的疫苗是否能应对不同PFGE型菌株的流行值得关注。