Chemical comparison of Semen Euphorbiae and Semen Euphorbiae Pulveratum by UPLC-Q-TOF/MS coupled with multivariate statistical techniques

In the present study,we aimed to assess the chemical composition changes of Semen Euphorbiae(SE)and Semen Euphorbiae Pulveratum(SEP)by UPLC-Q-TOF/MS and multivariate statistical methods.The UPLC-Q-TOF/MS method and SIMCA-P software were used to analyze the changes of chemical components of SE and SEP based on PCA and PLS-DA multivariate statistical methods.A"component-target-disease"network model was constructed by Intelligent Platform for Life Sciences of traditional Chinese medicine(TCM)to predict potential related diseases.The differences of chemical composition were significant between SE and SEP.Under positive ion mode,the amounts of Euphorbia factor L2,L3,L7a,L8,L9 and lathyrol were obviously decreased after processing.Under negative ion mode,the amounts of aesculetin,bisaesculetin,ingenol and cetylic acid were increased obviously,while Euphorbia factor L1,L4 and L5 were decreased obviously after processing,and the components of euphobiasteroid,aesculetin,lathyrol and linoleic acid among the 14 differentiated compounds were closely related to the SE-related diseases through the"component-target-disease"network model.UPLC-Q-TOF/MS technology in combination with multivariate statistical methods had certain advantages in studying the complex changes of chemical composition before and after manufacturing pulveratum of SE.It provided a basis for clarifying the toxicity-attenuated mechanisms of SE manufacturing pulveratum,and laid the foundation for its further development and utilization.

柏子仁制霜工艺比较研究

目的比较研究柏子仁的传统及现代制霜工艺,寻找制霜新方法。方法以制霜效率,脂肪油含量及其酸败度为指标,考察柏子仁不同制霜方法的优劣;并采用薄层色谱法和气相色谱法比较其脂肪油成分是否一致。结果机械压榨法与传统法相比,制霜效率高,成品质量均一,酸败度变化较小,脂肪油化学成分基本一致。结论机械压榨法可以取代传统法制柏子仁霜。

十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳比较加热前后巴豆霜蛋白成分的变化

目的:研究巴豆霜蛋白成分加热前后发生的变化,为选择巴豆霜加热炮制减毒方法提供数据支持。方法:采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳对不同炮制方法和不同加热时间制备的巴豆霜进行蛋白含量测定和电泳图谱分析。结果:测定了巴豆霜蛋白含量,发现巴豆霜不同炮制品SDS图谱中,分子量15～170kD内的特征性条带有6条,加热后有明显的条带消失现象。结论:SDS电泳操作简便、结果可靠、重现性好、专属性强,可用于鉴别不同炮制方法和不同加热时间的巴豆霜。

加热炮制对巴豆霜溶血效应影响的初步研究

目的:对巴豆霜蛋白成分加热前后发生的溶血效应的变化加以研究,为巴豆霜加热炮制减毒提供依据。方法:对不同炮制方法和不同加热时间制备巴豆霜所含巴豆毒蛋白的溶血现象发生情况进行比较,观察溶血行为。结果:发现巴豆霜蛋白加热后有明显溶血效应消失的现象,并与加热时间有一定相关性。结论:具溶血效应的巴豆霜蛋白在炮制后发生变性,其溶血效应可用于巴豆霜减毒质量控制。

甲状腺粉诱导大鼠甲亢过程中心肌微粒体ATP酶活性变化及丹参酮Ⅱ_A磺酸钠的保护作用

给大鼠口服甲状腺粉，每只８ｍ ｇ／ｄ，连续３０ ｄ，大鼠出现甲亢体征，检测心肌微粒体Ｎａ＋ 、Ｋ＋ －ＡＴＰａｓｅ，Ｃａ２＋ －ＡＴＰａｓｅ 和Ｍｇ２＋ －ＡＴＰａｓｅ 活性。结果：甲状腺粉组以上各项指标分别为７．６±１．３ ，１６．５±１．８和２１．８±２．２μｍ ｏｌＰｉ／ｇＨｂ ／ｈ，均明显低于丹参酮ⅡＡ 磺酸钠组和对照组（Ｐ＜ ０．０１）；丹参酮ⅡＡ 磺酸钠组和对照组比较无显著性差别（Ｐ＞０．０５）。上述结果表明，甲状腺粉诱导甲亢过程中心肌微粒体ＡＴＰａｓｅ 活性降低；丹参酮ⅡＡ

柏子仁及其炮制品对便秘小鼠肠道菌群的影响

目的:探究生柏子仁及柏子仁霜对便秘模型小鼠肠道菌群的影响。方法:采用盐酸洛哌丁胺制造小鼠便秘模型,采用粪便含水量测定和小肠推进率验证小鼠便秘模型。利用16SrDNA宏基因组测序对便秘小鼠粪便中的菌群进行分析,研究生柏子仁、柏子仁霜对肠道菌群的影响。结果:生柏子仁组和柏子仁霜组对肠道菌群丰度产生影响,菌群科、属、种水平上相对丰度皆有差异。与模型组比较,生柏子仁组及柏子仁霜组菌种差异性均比较大的4种菌种是Candidatus_Saccharimonas、Enterorhabdus、Muribaculum、Ruminococcaceae_UCG-004。结论:生柏子仁和柏子仁霜缓解便秘可能与调节肠道菌群相关。

千金子制霜前后提取物对肠道酶影响

目的 ：研究千金子生品和霜品对大鼠小肠黏膜中的乳酸脱氢酶（LDH）、苹果酸脱氢酶（MDH）和乳糖酶3种消化酶作用的差异。方法 ：将56只Wistar大鼠随机分成空白对照组、生品高剂量组（23.3529 g·kg^-1）、生品中剂量组（11.6764 g·kg^-1）、生品低剂量组（5.8382 g·kg^-1）、霜品高剂量组（23.3529 g·kg^-1）、霜品中剂量组（11.6764 g·kg^-1）、霜品低剂量组（5.8382 g·kg^-1）,每组8只。对照组给予生理盐水,其余6个给药组分别灌胃千金子制霜前后提取物高、中、低剂量的混悬液,每天给药1次,连续给药4 d,取材并处理后采用比色法检测大鼠小肠黏膜LDH、MDH和乳糖酶活性。结果 ：千金子生品和霜品均会降低大鼠小肠黏膜LDH、MDH和乳糖酶的活性（P〈0.05）,且酶的活性随着给药剂量的增大而减小,相同剂量下,千金子霜品实验组大鼠的3种肠道酶活性大于千金子生品实验组大鼠的3种肠道酶活性（P〈0.05）。结论 ：千金子生品和霜品可以降低小肠3种消化酶的活性,且与给药剂量有一定的关系,同种剂量下,千金子制霜后对肠道酶活性的降低程度小于生品,表明制霜后毒性降低,从肠道酶的角度可以证明千金子制霜减毒的科学性。

千金子制霜前后对大鼠消化间期复合肌电及胃肠激素的影响

目的观察千金子制霜前后石油醚提取物对大鼠十二指肠消化间期复合肌电(IMC)活动及组织匀浆P物质(SP)和血管活性肠肽(VIP)含量的影响,探讨制霜缓解千金子毒性的机制。方法将24只SD大鼠随机分为空白组、千金子生品石油醚提取物组和千金子霜品石油醚提取物组,每组8只。各给药组给予相应剂量(10 g原药材/kg)药液灌胃,空白组给予等量生理盐水灌胃。采用BL-420F生物机能实验系统测定千金子制霜前后大鼠十二指肠IMC慢波频率、振幅及峰电位数目;ELISA检测大鼠十二指肠组织匀浆SP和VIP含量。结果与空白组比较,千金子制霜前后均能兴奋大鼠胃肠肌电活动,十二指肠组织匀浆SP和VIP含量明显降低(P<0.01),制霜后各指标强度均小于生品(P<0.01)。结论千金子可能通过影响大鼠SP、VIP的分泌,进而影响消化道平滑肌胃肠电变化,引起胃肠道平滑肌收缩/舒张失衡,肠黏膜免疫调节紊乱,而制霜后使其水平趋于正常,从而改善胃肠道动力及胃肠道刺激性。

基于网络药理学探讨巴豆制霜的作用机制

目的:运用网络药理学方法探讨巴豆制霜增效减毒的机制。方法:通过中医药整合药理学研究平台V2.0获取并筛选巴豆、巴豆霜的成分和靶点,采用admetSAR-2.0获取巴豆主要成分的药动学和毒理学参数。将巴豆、巴豆霜共有靶点和巴豆特有靶点通过STRING 11.0数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络,采用DAVID进行京都基因与基因组百科全书通路富集分析,利用Cytoscape 3.8.0构建成分-靶点-通路网络,并进行网络拓扑分析。结果:经分析得到巴豆、巴豆霜共有成分6个和靶点202个,巴豆特有成分31个和靶点107个。巴豆、巴豆霜共有成分均能透过血脑屏障并被人体小肠吸收。巴豆发挥药效涉及尼古丁成瘾、GABA能突触和Rap1信号通路等通路。巴豆表现毒性涉及脂肪酸代谢通路、PPAR信号通路等。巴豆制霜机制可能与苯丙胺成瘾和长时程增强等神经系统通路相关。结论:巴豆制霜具有增效减毒作用,与多个靶点和通路相关,探讨靶点和通路有助于阐释巴豆制霜机制。

不同制霜方法制备巴豆霜饮片质量比较

目的:研究不同制霜方法对巴豆霜饮片质量的影响,为炮制巴豆霜时选择合适的制霜方法提供依据。方法:采用《中华人民共和国药典》2010版巴豆霜标准项下收载的检测方法和文献报道的溶血实验法,对压榨法、稀释法、加热稀释法、提油返油法4种方法制备的巴豆霜进行薄层色谱鉴别、含量测定及溶血实验。结果:4种方法制备的巴豆霜中巴豆苷的含量排序:提油返油法>压榨法>加热稀释法>稀释法,其中提油返油法和稀释法制备的巴豆霜有明显溶血现象。结论:中华人民共和国药典收载的稀释法由于辅料淀粉的加入,巴豆有效成分含量降低且有溶血效应。相比而言,中华人民共和国药典规定的压榨法更适合作为巴豆制霜方法。

马钱子碱、马钱子总生物碱与马钱子粉在大鼠体内药动学的比较

目的:研究马钱子碱、马钱子砂烫炮制品总生物碱与马钱子粉在大鼠体内的药动学规律,探寻单成分与整体之间的相互影响。方法:给各组大鼠分别灌胃给予马钱子碱溶液、马钱子砂烫炮制品总碱溶液及马钱子粉混悬液,采用高效液相色谱测定大鼠体内马钱子碱的血浆浓度,血药浓度-时间曲线经3P97软件包进行房室模型拟合并计算和比较各组药物动力学参数。结果:马钱子碱在大鼠体内的代谢过程符合二室模型,权重W=1/C2,方差分析结果表明,相同剂量的马钱子碱在3组不同的存在形式中,马钱子碱溶液组与马钱子砂烫炮制品总生物碱组在Cmax,MRT有显著性差异(P<0.05);马钱子碱溶液组与马钱子粉混悬液组在Cmax,AUC0-t,AUC0-∞有显著性差异(P<0.05),其中马钱子粉混悬液组值最小。结论:马钱子砂烫炮制品总生物碱组可相对延长马钱子中有效成分马钱子碱的血浆滞留时间,马钱子粉混悬液组的生物利用度较低。

巴豆不同炮制品肠道毒性差异及炮制对巴豆脂肪油、总蛋白的影响

为考察不同巴豆制霜过程对巴豆脂肪油、总蛋白及致肠道毒性的影响,将巴豆生品进行热压去油,冷压去油和淀粉稀释法炮制,得3种巴豆制霜品。小鼠灌胃给药,采用ELISA法测定小鼠血清中二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸含量,考察肠道通透性的变化;采用Western blot法测定不同肠段中紧密连接蛋白(occludin,claudin-1)表达变化,考察巴豆生品及其制霜品对肠道损伤的毒性差异。分别采用GC-MS和SDS-PAGE分析巴豆制霜前后脂肪油和总蛋白的变化。结果显示,巴豆生品能够显著增加小鼠肠道通透性和降低十二指肠、空肠紧密连接蛋白表达。制霜后小鼠肠道通透性和紧密连接蛋白表达均趋向正常,毒性降低。不同巴豆霜肠道毒性大小为:冷压巴豆霜>稀释巴豆霜≈热压巴豆霜。3种巴豆霜脂肪油成分组成一致,但总蛋白含量和组成具有明显差异。含量高低:冷压巴豆霜>热压巴豆霜>稀释巴豆霜,其中冷压和稀释巴豆霜总蛋白条带相对分子质量分布一致,热压巴豆霜总蛋白组成发生显著变化,条带减少,变淡。表明在巴豆制霜中,稀释和加热过程均能够降低蛋白含量,且加热导致部分蛋白变性失活。稀释和加热均能降低巴豆霜毒性,但加热过程减毒作用更显著,表明加热是巴豆制霜过程中的关键步骤。

基于利尿作用及肠道菌群结构的巴豆霜与甘草配伍禁忌机制研究

该研究基于课题组前期发现的"藻戟遂芫"与甘草配伍致毒增毒特点,以利尿作用和肠道菌群结构为表征指标,拓展性开展功效相似、基原相近、化学成分类型类同的中药巴豆霜与甘草合用可能导致的减效增毒作用研究。结果显示,甘草与高剂量巴豆霜合用,可减缓巴豆霜的快速利尿作用,表现为一定的降效作用趋势;巴豆霜高、低剂量均可显著损伤小鼠小肠组织,并使其肠道菌群组成结构发生显著变化。低剂量巴豆霜合用甘草后可使有害菌属Streptococcus(链球菌属)和Rikenellaceae_ukn的水平显著升高,高剂量巴豆霜和甘草合用后致病菌属Desulfovibrio(脱硫弧菌属)和Streptococcaceae_ukn相对丰度升高,两药合用进一步扰乱了肠道微生物稳态,且提示有引发肝脏及肠道炎症的风险。研究结果从巴豆霜传统功效及其对肠道菌群结构影响方面证实巴豆霜与甘草合用具有一定的降效增毒作用趋势,为巴豆霜临床安全用药提供了数据支持。

马钱子粉中士的宁和马钱子碱含量测定方法的研究

目的通过研究,建立可操作性更强的马钱子粉中指标成分的含量测定方法及限度范围。方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-水(38∶62),每1000mL中含磷酸二氢钾3.4g和十二烷基硫酸钠1.7g为流动相;检测波长为260nm;理论板数按士的宁峰计算应不低于5000。结果以干燥品计,10批不同批号的马钱子粉中士的宁的平均含量为0.86%,马钱子碱的平均含量为0.63%,10批样品士的宁的组间平均误差(绝对值)为11.50%。以干燥品计,同一批号10份马钱子粉样品中士的宁的平均含量为0.83%,马钱子碱的平均含量为0.69%,10份样品士的宁的组内平均误差(绝对值)为7.88%。结论根据马钱子粉制备和测定两个环节的累积总误差(约20%),建议将马钱子粉中士的宁的限度范围修订为:按干燥品计算,含士的宁应为0.64%～0.96%;而马钱子碱仍定为不得少于0.50%。这既可保证马钱子粉的有效与安全,又可大大提高马钱子粉制备过程中的可操作性。

基于小鼠胃肠道系统毒性及利尿效应的大枣与巴豆霜配伍减毒机制研究

研究大枣对巴豆霜胃肠毒性及利尿效应的干预作用。将48只小鼠随机分为空白对照组(control)、巴豆霜低剂量组(0.039 g·kg^(-1)·d_(-1), CTL)、巴豆霜高剂量组(0.078 g·kg^(-1)·d_(-1), CTH)、大枣水提液组(9.75 g·kg^(-1)·d_(-1), JF)、巴豆霜低剂量与大枣配伍组(巴豆霜0.039 g·kg^(-1)·d_(-1),大枣9.75 g·kg^(-1)·d_(-1), JFCTL)、巴豆霜高剂量与大枣配伍组(巴豆霜0.078 g·kg^(-1)·d_(-1),大枣9.75 g·kg^(-1)·d_(-1), JFCTH),每组8只。各组于给药第9天进行排尿量测定;给药10天后,收集新鲜粪便样品,采用16S rDNA测序的方法研究巴豆霜和大枣配伍前后肠道菌群的变化。所有实验方案均经南京中医药大学动物伦理委员会批准。结果表明,大枣与巴豆霜合用可减缓巴豆霜的快速利尿作用,显著上调单用巴豆霜后下降的血清白介素-2 (IL-2)、白介素-6 (IL-6)、胃泌素(GAS)和生长抑素(SS)水平,减轻巴豆霜导致的小鼠小肠组织损伤,并改善其引起的肠道菌群失调。大枣合用低剂量巴豆霜后可使Sphingomonas、Oscillospira的相对丰度显著降低,大枣合用高剂量巴豆霜后致病菌属Bilophila水平降低。本研究表明大枣与巴豆霜配伍应用可在血清免疫指标、肠道运动、肠道损伤、肠道菌群结构等方面表现出一定的配伍减毒作用趋势。此外,大枣尚可减缓巴豆霜的逐水药势,呈现出一定的降效作用。

大黄、巴豆霜对溃疡性结肠炎大鼠CD4~＋CD25~＋Treg的影响

目的:探讨巴豆霜、大黄及其成分是否通过维持CD4+CD25+Treg平衡,发挥溃疡性结肠炎(UC)大鼠的治疗作用。方法:采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法复制UC大鼠模型,将40只大鼠随机分为空白对照组、模型组、巴豆霜+大黄组、巴豆霜+没食子酸组、巴豆霜+大黄素组。观察结肠大体形态损伤、组织学变化,测定各组大鼠外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg淋巴细胞变化。结果:与正常组比较,模型组大鼠外周血Treg细胞降低显著(P<0.01)。与模型组相比,巴豆霜+大黄组、巴豆霜+没食子酸组结肠大体形态损伤、组织学变化显著改善。治疗1周后,和模型组比较,巴豆霜+大黄组,巴豆霜+没食子酸组大鼠外周血Treg细胞有显著增高(P<0.01或P<0.05),且两组间比较没有差异;而巴豆霜+大黄素组没有差异(P>0.05)。结论:巴豆霜+大黄、巴豆霜+没食子酸对大鼠UC具有显著治疗作用,提高大鼠外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞可能是其作用机制之一,没食子酸是大黄和巴豆霜配伍发挥止泻作用的有效物质之一。

千金子制霜前后提取物在体外对人正常肝细胞LO2的毒性作用研究

目的比较千金子制霜前后提取物对LO2细胞毒性的影响并探究千金子制霜减毒的作用机制。方法将人肝LO2细胞分为7组:千金子生品低、中、高3个剂量组、千金子霜品低、中、高3个剂量组和阴性对照组。将细胞培养48 h后,分别予以100,200,400μg·mL^(-1)的千金子生品、千金子霜品供试品溶液和等体积的无血清细胞培养液,各组设置3个复孔。分别用PI染色法和Annexin V-FITC/PI双重染法来检测细胞周期和凋亡情况,试剂盒法检测乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和Na^(+)-K^(+)-ATP酶的活力。结果阴性对照组、千金子生品低、高2个剂量组、千金子霜品低、高2个剂量组的细胞G2/M期比例依次为(22.47±2.29)%,(13.63±0.88)%,(6.12±0.83)%,(18.03±0.73)%和(9.88±0.75)%^;这5组总凋亡率依次为(3.87±0.12)%,(9.93±0.05)%,(12.80±0.28)%,(6.90±0.08)%和(9.73±0.09)%。阴性对照组、千金子生品低、中、高3个剂量组、千金子霜品低、中、高3个剂量组的LDH活力依次为(21.66±1.78),(257.77±13.09),(452.44±10.80),(798.65±8.72),(145.16±5.65),(238.10±4.85)和(495.56±5.16) mU·mL^(-1);这7组的SOD活力依次为(17.03±0.41),(8.28±0.35),(6.01±0.37),(2.89±0.27),(12.87±0.21),(10.58±0.24)和(7.71±0.44) U·mg^(-1);这7组的Na^(+)-K^(+)-ATP酶活力依次为(15.84±0.54),(8.47±0.66),(7.00±0.13),(3.64±0.17),(12.88±0.40),(10.79±0.22)和(8.45±0.13) U·mg^(-1)。上述指标,千金子生品低、中、高3个剂量组与阴性对照组相比,差异均有统计学意义(均P<0.01)^(+)千金子霜品3个剂量组与千金子生品3个剂量组相比,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论千金子制霜后可能通过减轻细胞氧化损伤,降低细胞膜通透性,改善肝细胞功能损伤,减少细胞凋亡来降低体外肝毒性。