Pup-蛋白酶体系统的作用机制和生物学功能

Pup-蛋白酶体系统(Pup-proteasome system,PPS)是原核生物的一种翻译后蛋白质修饰降解体系,在去酰胺酶(deamidase of Pup,Dop)和蛋白酶体辅助因子A(proteasome accessory factorA,PafA)两种酶的作用下,原核生物类泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein,Pup)可以标记靶蛋白,并介导靶蛋白经蛋白酶体降解。在分枝杆菌中PPS参与氧化应激、营养缺乏、热激、DNA损伤等多种应激反应,并在金属离子稳态调控、毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TA system)的调节以及抵抗宿主免疫等过程中发挥作用。PPS与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)的持留性和致病性直接相关,因此PPS中的PafA、Dop和蛋白酶体均是抗结核药物开发的新靶点,筛选针对PPS的小分子抑制剂将成为新型抗结核药物研发的一个新途径。此外,Paf A催化的蛋白质Pup化被应用于生物技术的研发,形成了一种新的邻近标记技术——基于Pup化的邻近标记技术(pupylation-based interaction tagging,PUP-IT),应用于蛋白质相互作用的研究。本文综述了Pup-蛋白酶体系统的作用机制及其生物学功能研究的进展,并探讨了该系统在抗结核药物和生物技术研发中的应用前景。

结核杆菌Pup-蛋白酶体系统与耐药结核杆菌耐药性的相关性研究

目的:检测不同耐药的结核杆菌临床分离株原核类泛素蛋白-蛋白酶体系统(以下简称:Pup-蛋白酶体系统)相关的Pup、Dop、PafA、Mpa基因的表达水平,探讨研究结核杆菌Pup-蛋白酶体系统与新疆地区广泛流行的耐药结核杆菌临床分离株耐药性的相关性。方法:以培养对数生长期的新疆地区广泛流行的耐药结核杆菌临床分离株为研究对象,分别提取结核杆菌临床分离的药物敏感菌株、单纯耐异烟肼的结核杆菌临床分离株(INH-MTB)、单纯耐利福平的结核杆菌临床分离株(RFP-MTB)、单纯耐链霉素的结核杆菌临床分离株(SM-MTB)、单纯耐乙胺丁醇的结核杆菌临床分离株(EB-MTB)、耐多药结核杆菌临床分离株(MDR)等各组菌株的总RNA,经纯度鉴定后,利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,检测各组结核杆菌菌株的Pup、Dop、PafA、Mpa基因的表达水平,分析各组耐药结核杆菌临床分离株Pup-蛋白酶体系统相关的Pup、Dop、PafA、Mpa基因的表达与新疆地区广泛流行的耐药结核杆菌临床分离株耐药性的相关性。结果:与药物敏感菌株相比,Pup、Mpa基因在单一耐药菌株和耐多药菌株中表达有不同程度的下调,Dop、PafA基因在单一耐药菌株和耐多药菌株中表达有不同程度的上调,差异有统计学意义(P<0.05)。与MDR相比,Pup、Dop、Mpa基因在单一耐药菌株中表达有不同程度的上调,PafA基因在单一耐药菌株中表达有不同程度的下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在结核杆菌临床分离的药物敏感菌株、INH-MTB组、RFP-MTB组、SM-MTB组、EB-MTB组和MDR组中,结核杆菌Pup、Dop、PafA、Mpa基因的表达差异,与新疆地区广泛流行的耐药结核杆菌临床分离株耐药性有相关性。

结核杆菌Pup-蛋白酶体系统与结核杆菌持留性的相关性研究

目的:本研究通过诱导结核杆菌在低氧环境中进入持留状态,比较分析不同时间点、不同环境下结核杆菌Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的表达水平差异,探讨研究Pup-蛋白酶体系统对结核杆菌持留性的调控作用。方法:本实验以结核杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株(以下简称为H37Rv菌株)为研究对象,在低氧、有氧环境下进行培养,分别提取不同时间点每组样本菌株的总RNA,并进行纯度鉴定。运用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的方法,分别检测各组结核杆菌菌株的Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的表达;比较分析不同时间点、不同环境下的各结核杆菌菌株Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的表达水平差异。结果:在不同时间点对低氧环境下菌株Pup、Dop、Paf A和Mpa的表达水平进行检测,Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的相对表达水平:低氧环境下,与0 d比较,Pup基因在4 d、7 d、10 d分别上调1.66、2.43、2.76倍,Dop基因在2 d、4 d、7 d、10 d分别上调1.38、1.91、2.54、3.28倍,Paf A基因在2 d、4 d、7 d、10 d分别上调1.22、1.75、2.37、2.67倍,Mpa基因在4 d、7 d、10 d分别上调1.66、2.21、2.63倍(P<0.05);以有氧环境组做对照,低氧环境下,相同时间点,Pup基因在4 d、7 d、10 d分别上调1.85、2.81、2.93倍,Dop基因在2 d、4 d、7 d、10 d分别上调1.20、1.76、2.01、3.01倍,Paf A基因在2 d、4 d、7 d、10 d分别上调1.22、1.57、2.29、2.29倍,Mpa基因在2 d、4 d、7 d、10 d分别上调1.16、1.58、2.16、2.69倍(P<0.05)。结论:低氧环境下,不同时间点,Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的相对表达量存在差异;以有氧环境组作对照,相同时间点,低氧环境下与有氧环境下Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的相对表达量也存在差异。Pup-蛋白酶体系统对结核杆菌持留性具有一定的调控作用。

结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统研究进展

蛋白酶体途径是真核细胞中除溶酶体外降解蛋白质的又一主要途径,参与细胞的多项生理功能调控。2008年在结核分枝杆菌中发现了原核类泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein,Pup)。Pup在辅助因子Dop、PafA、Mpa的作用下,可以泛素化标记多种蛋白,再将其导入蛋白酶体降解。Pup-蛋白酶体系统的靶蛋白FabD、PanB、Ino1、Icl、SodA、MtrA等涉及物质代谢、信号传导通路、毒性因子、致病性、细菌在宿主体内的持留等多个方面。蛋白酶体抑制剂使蛋白酶体的功能受到限制,Pup标记底物的累积导致的基因表达的间接改变,对结核分枝杆菌抗外界压力和致病性的能力产生影响。Pup-蛋白酶体系统的发现揭示了原核生物中一个崭新的蛋白质降解机制,有望成为抗结核病药物治疗的新靶点。本文对结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体的研究进展作一综述。

结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Pup-蛋白酶体系统Pup基因、Mpa基因、Dop基因和PafA基因缺失突变株的构建

目的利用SOE-PCR技术和T载体技术,快速构建结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Pup-蛋白酶体系统Pup基因、Mpa基因、Dop基因和PafA基因缺失突变株,为进一步研究结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统的功能奠定基础。方法基于同源重组原理,利用SOE-PCR技术和T载体技术分别将各待缺失基因的上下游同源臂与卡那霉素抗性基因融合,构建各基因缺失突变盒;将各基因缺失突变盒与T-Vector pMD 19(Simple)相连接,构建各基因缺失突变自杀载体;利用电穿孔技术将各载体转入H37Rv菌株,通过筛选阳性克隆、菌落PCR鉴定、DNA测序及遗传稳定性检测,获得各目的基因的缺失突变株。结果成功构建了带有1 601bp的特异性置换片段Pup-N-K和1 591bp的特异性置换片段K-Pup-C的Pup基因缺失突变株H37Rv△Pup,带有1 604bp的特异性置换片段Mpa-N-K和1 602bp的特异性置换片段K-Mpa-C的Mpa基因缺失突变株H37Rv△Mpa,带有1 515bp的特异性置换片段Dop-N-K和1509bp的特异性置换片段K-Dop-C的Dop基因缺失突变株H37Rv△Dop及带有1 590bp的特异性置换片段PafA-N-K和1 584bp的特异性置换片段K-PafA-C的PafA基因缺失突变株H37Rv△PafA,且各突变株均具有良好的遗传稳定性。结论利用SOE-PCR技术和T载体技术可以快速构建结核分枝杆菌基因缺失突变株,依据此方法成功构建了H37Rv菌株Pup-蛋白酶体系统Pup基因、Mpa基因、Dop基因和PafA基因缺失突变株,为进一步研究结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统的功能奠定了基础。

结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统与不同毒力结核分枝杆菌致病性的相关性研究

目的通过比较分析不同毒力结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA和Mpa基因的表达差异,探讨Pup-蛋白酶体系统与不同毒力结核分枝杆菌致病性的相关性。方法分别提取卡介苗菌株(BCG)、结核分枝杆菌国际标准无毒珠(H37Ra)、结核分枝杆菌国际标准强毒珠(H37Rv)、新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株总RNA,并进行纯度鉴定。运用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA和Mpa基因的表达,比较分析不同毒力结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA和Mpa基因的表达差异。结果 H37Rv菌株和新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株与BCG菌株相比,Pup基因表达分别上调1.67、2.65倍,Dop基因表达分别上调2.42、3.69倍,PafA基因表达分别上调4.09、7.36倍,Mpa基因表达分别上调2.65、3.91倍,差异有统计学意义(P<0.05);BCG、H37Ra、H37Rv菌株与新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株相比,Pup基因表达分别下调62%、59%、37%倍,Dop基因表达分别下调63%、64%、34%倍,PafA基因表达分别下调87%、86%、44%倍,Mpa基因表达分别下调64%、67%、32%倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在BCG、H37Ra、H37Rv、新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株Pup、Dop、PafA和Mpa基因的表达有差异性,且与菌株毒力呈正相关。Pup-蛋白酶体系统与不同毒力结核分枝杆菌致病性具有相关性。

耐药结核杆菌原核类泛素蛋白(Pup)-蛋白酶体系统基因表达的研究

目的:检测分析经过不同浓度的抗结核药物培养后的各组耐药结核杆菌临床分离株和原始耐药状态的耐药Mtb临床分离株原核类泛素蛋白(Pup)-蛋白酶体系统基因的表达差异,探讨研究经过不同浓度抗结核药物的抗生素选择压力作用后,各组耐药Mtb菌株中的Pup-蛋白酶体系统的基因表达是否与新疆地区广泛流行的耐药Mtb临床分离株耐药性相关。方法:将单纯耐异烟肼的Mtb临床分离株(INH-Mtb)、单纯耐利福平的Mtb临床分离株(RFP-Mtb)、单纯耐链霉素的Mtb临床分离株(SM-Mtb)、单纯耐乙胺丁醇的Mtb临床分离株(EB-Mtb)、耐多药的Mtb临床分离株(MDR),分别在原始耐药状态、低浓度含药培养基和高浓度含药培养基上培养至对数生长期,分别提取各组耐药Mtb菌株的总RNA,利用SYBR Green I实时荧光定量PCR的方法检测各组耐药Mtb菌株在不同浓度抗结核药物的抗生素选择压力作用的Pup-蛋白酶体系统基因的表达水平。结果:与原始耐药状态下耐药Mtb菌株相比较,经低浓度抗结核药物压力作用培养后的各组Mtb菌株,Pup基因在INHMtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR组中的表达分别下调0.74、0.23、0.28、0.57倍;Dop基因表达分别上调1.33、1.63、1.14、2.88倍;Paf A基因表达分别上调1.69、1.30、1.58、1.32倍;Mpa基因表达分别上调3.05、1.79、1.31、2.27倍,差异有统计学意义(P<0.05);与原始耐药状态下耐药Mtb菌株相比较,经高浓度抗结核药物压力作用培养后的各组Mtb菌株,Pup基因在INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR组中的表达分别下调0.58、0.37、0.43、0.78倍;Dop基因表达分别上调2.62、2.49、1.69、2.95倍;Paf A基因表达分别上调2.16、1.48、2.02、2.21倍;Mpa基因表达分别上调1.63、3.22、1.13、3.94倍,差异有统计学意义;(P<0.05)。结论:经过不同浓度抗结核药物的抗生素选择压力作用后各组Mtb菌株中Pup-蛋白酶体系统的Pup基因、Dop基因、Mpa基因和Paf A基因的表达有差异,提示结核杆菌Pup-蛋白酶体系统的基因表达与新疆地区广泛流行的耐药Mtb临床分离株耐药性相关。