上游法及PureSperm密度梯度离心法优选精子的效果比较

40份精液分别采用上游法与PureSperm离心法进行优选,用计算机辅助精液分析(CASA)及彗星试验评价优选后的精子质量。两种方法优选后,精子活率、活力、轨迹速度等运动参数及精子核彗星细胞率相比,P均>0.05。两种方法处理后精子回收率(分别为42.70%±4.36%、15.58%±6.68%)相比,P<0.01。表明两种方法均可优选精子,PureSperm密度梯度离心法精子回收率高于上游法。

浮游板优化精液与密度梯度离心结合上游法的比较

目的应用浮游板和密度梯度离心结合上游法优化人类精液,明确优化效果并比较两种方法优化后精子参数的差异。方法收集正常精液样本85例和轻中度少弱精子症精液样本59例,每例样本分为原液组、密梯组和浮游组各1 ml进行后续处理。原液组在精液液化后未做任何处理;密梯组精液液化后用密度梯度离心法结合上游法进行处理,浮游组则在精液液化后应用精子浮游板进行处理。比较原液组、密梯组、浮游组3个亚组间的精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率;应用流式细胞仪检测精子线粒体膜电位和精子DNA碎片指数,使用单精子活性氧分析仪检测单精子活性氧水平,使用电子显微镜观察精子超微结构并进行组间比较。结果无论是正常精液还是轻中度少弱精子症精液,与原液组比较,密梯组与浮游组的前向运动精子百分率、正常形态精子百分率及精子线粒体膜电位均显著升高(P<0.05),精子DNA碎片指数显著降低(P<0.05);密梯组和浮游组各指标无显著性差异(P>0.05)。正常精液中,浮游组的精子浓度显著高于密梯组(P=0.029),单精子活性氧水平显著低于原液组(P=0.038)。轻中度少弱精子症精液中3亚组间的单精子活性氧水平均无显著性差异(P>0.05)。电子显微镜观察发现正常精液中3个亚组的精子均未见明显异常;轻中度少弱精子症精液中密梯组部分精子可观察到精子细胞膜断裂和线粒体肿胀等异常,而浮游组精子超微结构未见明显异常。结论密度梯度离心结合上游法和浮游板法用于精液的处理和优化,均可有效回收活力、形态和功能更好的精子。精子浮游板法的体外干预小,操作简便,可以获得活性氧更少、损伤更小的精子。

葡聚糖与蔗糖密度梯度离心制备膜微囊方法的比较

分别以不连续蔗糖［２２０／３６０／４５０（ｇ／Ｌ）］和葡聚糖（ｄｅｘｔｒａｎＴ７０）［６０／１２０（ｇ／Ｌ）］两种介质密度梯度，制备并比较了大麦幼根细胞质膜和液泡膜微囊。结果表明，两种介质梯度制备的质膜微囊纯度较高，无线粒体膜和液泡膜污染；液泡膜微囊虽基本上去除了线粒体膜，但均混有少量质膜碎片。用蔗糖梯度制备的质膜微囊较葡聚糖梯度制备的质膜微囊有较高的翻转比率；对液泡膜微囊，前者的原位比例也较后者略高。另外，液泡膜Ｈ＋－ＰＰａｓｅ活性测定反应体系中应加入钼酸钠抑制剂，反应终止液和显色液可与Ｈ＋－ＡＴ－Ｐａｓｅ相同。因此，在制备质膜和液泡膜进行Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ或Ｈ＋－ＰＰａｓｅ生化特性的研究时，可用蔗糖代替葡聚糖。

密度梯度离心法分离精子在宫腔内人工授精中的应用

目的:探讨密度梯度离心法应用于宫腔内人工授精的精子分离时精子指标的变化及精子形态对回收率的影响。方法:选择2008年9-10月间所有进行宫腔内夫精人工授精的51份精液,采用密度梯度离心法分离精子,记录精子分离前后的各项指标,计算回收率并作统计分析。结果:(1)精子存活率由(53.63±15.94)%提高至(88.75±9.69)%(P<0.05),平均回收率为(25.84±16.57)%。(2)正常形态精子比例由9%提高至18%(P<0.05),各类畸形精子均显著减少,尤其颈部和尾部畸形的精子减少最为明显。(3)根据处理前精子正常形态的比例分为≤4%、5%～14%、≥15%3组,分离后精子存活率分别为(80.45±14.05)%、(91.32±7.30)%、(90.00±4.33)%(P=0.004),回收率分别为(19.67±10.49)%、(28.51±16.87)%、(41.14±15.02)%(P=0.013)。精子正常形态比例与回收率呈正相关(r=0.456,P=0.001)。结论:密度梯度离心法可以有效回收活力好、形态正常的精子,对于去除颈部和尾部畸形的精子效果更好,精子正常形态与回收率呈正相关。

应用密度梯度离心法分离扩增兔骨髓基质细胞的体会

目的 探讨密度梯度离心法分离培养兔骨髓基质干细胞 (BMSc)的条件 ,为组织工程学选择合适的种子细胞奠定基础。方法 采用密度梯度离心法将兔BMSc自小量骨髓中分离并培养 ,观察其增殖和生长特性 ,绘制生长曲线 ,测定分裂指数和贴壁率。结果 兔BMSc在第 7代前性状稳定 ,生长曲线相似 ;第 4天分裂指数最高为 15 % ;传代后 10h贴壁率高达 90 %。结论 密度梯度离心法是分离兔BMSc的理想方法 ,BMSc能为未来组织工程提供足量种子细胞。

联用密度梯度离心与免疫磁珠法分离纯化人表皮朗格汉斯细胞

目的:探讨获取较高纯度和活性的人表皮朗格汉斯细胞(LC)的实验方法。方法:联合采用密度梯度离心和免疫磁珠的方法分离纯化人表皮LC,将分选后的细胞用结合有异硫氰酸荧光素(FITC)的鼠抗人CD1a单抗标记,经流式细胞仪检测LC的纯化率,采用0.4%锥虫蓝染色检测细胞的活性。结果:分选所得LC纯化率为84.48%,锥虫蓝染色显示细胞活性>95%。结论:联用密度梯度离心和免疫磁珠法,可获得较高纯度、有活性的LC细胞,且具有操作简单、易于无菌条件下分离纯化的优点。

应用密度梯度离心和贴壁筛选法分离兔骨髓间充质干细胞(英文)

背景:特定条件下,骨髓间充质干细胞可向成骨细胞、成软骨细胞等细胞分化。但骨髓中间充质干细胞含量极低,体外如何获取、纯化并使其高效快速增殖是组织工程技术应用和推广的前提。目的:优化获取兔骨髓间充质干细胞并对其进行纯化、鉴定,同时对其生物学性状进行观察。设计、时间和地点:观察性实验,于2005-09/2006-07在同济医学院实验动物中心完成。材料:兔龄2个月雌性新西兰纯种大耳白兔1只,用于间充质干细胞取材及原代培养。方法:采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对抽取的骨髓液进行纯化。首先将培养瓶中的培养液吸出,加PBS后再加入2.5g/L胰酶约3.0mL,置于37℃培养箱中,两三分钟后在倒置显微镜下观察细胞形态,当细胞胞质回缩,细胞变瘦长,细胞间隙增大,同时有少量脱壁的圆形细胞时可终止消化,加入含血清的L-DMEM完全培养基即可。按1.0×108L-1的密度接种到一次性塑料培养瓶中进行培养。主要观察指标:间充质干细胞的形态、超微结构和表面标志物的表达;第1,3,5,8,10代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线。结果:①经密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代方法所得的间充质干细胞很纯,第3代和第5代细胞形态单一,细胞排列具有典型的漩涡状结构。②透射电镜观察显示间充质干细胞核大,以圆形或类圆形为主,胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞。③传代培养的间充质干细胞生长曲线呈S型,第1,3,5代细胞增殖能力强,细胞生长旺盛,而第8,10代细胞增殖明显减弱。④所分离培养的细胞表达CD44、CD90,不表达CD34,电镜观察为低分化细胞。结论:分离培养的细胞为间充质干细胞且成分单一,具有干细胞特性,第3代和第5代细胞很纯且其增殖能力强。

Ficoll密度梯度离心法分离猪外周血单个核细胞条件的探讨

目的探讨猪外周血单个核细胞(PBMC)最佳分离条件,为寄生虫免疫学研究提供有效的方法。方法使用猪淋巴细胞分离液,在不同离心转速和时间条件下分离猪PBMC,观察所得云雾状PBMC层的厚度,计算细胞得率及细胞活力,以确定猪淋巴细胞分离液分离猪PBMC的最佳实验条件。同时采用文献报道的人淋巴细胞分离液分离猪PBMC的分离条件(1500r/min,30min)分离猪PBMC,比较两者分离PBMC效果。结果使用猪淋巴细胞分离液(密度1.110ng/L),在20～25℃室温下以1500r/min(半径15cm)离心30min,接着低温(4℃)1500r/min离心10min,洗涤2次,这样获得的猪PBMC效果最好。同样条件下,用人的淋巴细胞分离液分离猪PBMC,不仅所得细胞沉淀中混杂细胞如红细胞及其他细胞碎片较多,而且PBMC细胞得率及活力也不好。结论本实验提出了获得大量有活力的猪PBMC的方法和条件。

犬骨髓间充质干细胞分离纯化和成骨诱导分化：Ficoll液密度梯度离心法体外分离的可行性

背景:目前骨髓间充质干细胞较经典的分离方法是Percoll密度梯度离心法,以去除血细胞成分,但该法操作较为复杂,分离犬骨髓时需要配制密度,且离心次数较多,对细胞损伤大。目的:拟建立可靠、高纯度的犬骨髓间充质干细胞体外分离纯化方法,并观察其在体外扩增、成骨诱导分化的能力。方法:于犬髂后上棘抽取骨髓液10mL,肝素抗凝,Hanks液稀释后,加入1.077g/mL Ficoll液3mL,2000r/min离心20min,吸取有核细胞形成白色云雾状的分层界面,用含胎牛血清的DMEM离心2遍,按12×104/cm2密度接种,于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养。细胞传代后,加入含地塞米松、β-磷酸甘油钠、L-2-磷酸抗坏血酸的DMEM成骨条件培养液进行诱导。免疫细胞化学染色和免疫荧光染色检测成骨细胞特征性分泌蛋白骨钙素、骨桥蛋白的表达,以及Ⅰ型胶原的表达,并进行碱性磷酸酶染色与茜素红染色。结果与结论:1.077g/mLFicoll液密度梯度离心法分离所得的有核细胞层相对于Percoll液分层明显,可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,接种细胞生长良好,平均倍增时间为24h。犬骨髓间充质干细胞体外成骨诱导培养后,骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原均呈阳性表达,碱性磷酸酶染色后细胞胞浆呈蓝绿色,茜素红染色后细胞外基质中出现散在的红色结节,可在体外定向分化为成骨细胞。

应用单层和双层密度梯度离心法处理男性不育症患者精液效果对比

目的评价单层和双层密度梯度离心法处理男性不育症患者精液并行宫腔内人工授精(artificial insemination with husband′s sperm,AIH IUI)的应用效果。方法连续收集在本中心施行IUI手术的男方精液标本500份,随机采用70%单层法(正常精子45份、轻度少精子症90份、轻度弱精子症90份)或90%+45%双层法(正常精子55份、轻度少精子症110份、轻度弱精子症110份)进行密度梯度离心,优选前后均进行精子质量和功能检测,并随访妊娠结局。结果经单层法优选后,正常精子组前向运动精子百分率(PR)和PR精子回收率低于双层法,轻度少精子症组精子总活力[PR+非前向运动镜子百分率(NP)]和PR+NP精子回收率高于双层法(均P<0.05);轻度弱精子症组经两种方法优选后,PR和PR+NP精子回收率高于正常精子组和轻度少精子症组(P<0.05);3组精液经两种方法优选后,正常形态精子百分率、诱发顶体反应(AR)率、DNA碎片化指数(DFI)、精子成熟度和精液白细胞浓度与处理前差异均有统计学意义(P<0.05);研究时间段内采用来曲唑(LE)促排方案的334个周期临床妊娠率,单层法68周期,正常精子15.38%,轻度少精子症14.81%,轻度弱精子症17.86%;双层法266周期,正常精子13.21%,轻度少精子症14.15%,轻度弱精子症15.89%(均P>0.05)。结论单层和双层密度梯度离心法均能筛选较高质量的精子,应根据不同病因患者的精液情况选用合适的优选方法。

应用等密度梯度离心法提纯传染性支气管炎病毒

采用分段取样，测OD260，及电镜观察等方法，对用等密度梯度离心法提纯的传染性支气管炎病毒粒子在蔗糖溶液中的病毒富集带和纤突丢失程度进行了分析和总结。提出梯度离心后30％～50％区带蔗糖溶液为较理想的取样位置。

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较

背景:目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法:密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想。目的:在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法。方法:全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度。结果与结论:全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高。

密度梯度离心法与直接上游法优化处理精液对宫腔内人工授精临床妊娠率的影响

目的:应用密度梯度离心法和直接上游法处理不明原因不孕和轻度精液异常患者的精液,比较两种方法对宫腔内人工授精(IUI)临床妊娠率的影响。方法:回顾性分析2013年1月至2014年12月期间,在我中心进行促排卵+IUI的571个周期患者,统计其精液优化处理方法和临床妊娠率。结果:总体临床妊娠率为密度梯度离心法(17.8%)显著高于直接上游法(11.4%)(P<0.05);不明原因不孕组的临床妊娠率为密度梯度离心法(33.7%)显著高于直接上游法(20.3%)(P<0.05);轻度精液异常组的临床妊娠率为密度梯度离心法(11.6%)显著高于直接上游法(7.6%)(P<0.05)。结论:密度梯度离心法相对直接上游法能有效提高因不明原因不孕和轻度精液异常患者IUI的临床妊娠率。

不同条件下Percoll密度梯度离心分离组织细胞浮游生物的比较

目的实验评估不同条件下Percoll密度梯度离心分离组织中浮游生物的效果。方法大白兔肝组织匀浆后与3种藻类混合物混匀,分为混匀高速分离组、混匀低速分离组、叠加高速分离组、叠加低速分离组和未分离组(对照组)进行Percoll密度梯度离心分离浮游生物,镜检并提取其DNA,用PCR技术分别检测浮游生物16S rDNA和叶绿素基因特异性片段。结果混匀高速分离组有较多浮游生物呈分层条纹状分布于离心管中部,叠加高速分离组浮游生物紧邻组织细胞层下,低速分离组见较少浮游生物紧邻于组织细胞层之下,未分离组见浮游生物和组织细胞混杂沉于管底;经DNA检测,各分离组组织细胞层下液体均可检出浮游生物的1条447bp 16S rDNA片段及1条194bp叶绿体/叶绿素脱辅基蛋白基因片段,未分离组均未检出扩增产物且背景较深。结论混匀加样方式进行高速Percoll密度梯度离心,合并收集组织细胞层下所有液体,是分离浮游生物的最有效方法。

用蔗糖密度梯度离心法纯化小球隐孢子虫卵囊试验

用蔗糖密度梯度离心法从接种犊牛粪便中纯化小球隐孢子虫卵囊 ,该方法操作简便、快速、经济、获得的卵囊纯度高 ,回收率达 92 .0 % ,适合于国内普通实验室使用。

用改良CsCl密度梯度离心法提取石蒜叶片和鳞茎总RNA

The total RNA is extracted from leaf and bulb of Lycoris radiata(L’Hér.)Herb.by an improved method of CsCl density gradient centrifugation.The suitable amount of initial sample is 1.0 g.In order to remove impurities and purify the total RNA,the crude extract of RNA dissolved in lysis buffer is extracted with the mixed solution of chloroform and isoamyl alcohol(V ∶V,24 ∶1),then the total RNA is precipitated.The purity,integrity and quality of the total RNA are detected by ultraviolet spectrophotometer,agarose gel electrophoresis and RT-PCR method,respectively.The results show that polysaccharide can be removed effectively from the total RNA extract by the improved method of CsCl density gradient centrifugation.The purity andintegrityof the total RNA of L.radiata are better,and the ratio of A260/A280 is 1.85-2.00.It is concluded that the total RNA of L.radiata bulb extracted by the improved method can satisfy the demand of molecular biology experiments.

宫腔内人工授精中应用上游法和密度梯度离心法的系统评价

背景:精子体外优选方法很多,最常见的是上游法和密度梯度离心法。采用何种方法来减少体外处理过程对精子的不良刺激,优选出具有良好受精潜能的精子,目前尚无定论。目的:系统评价上游法和密度梯度离心法在宫腔内人工授精中的应用,比较两种精子优选法的优劣。方法:计算机检索PubMed、Cochrane Library、EMBASE等数据库,手工检索专业相关期刊,检索时间为1966-01/2009-02。纳入关于两种精液优选法在宫腔内人工授精中应用的随机对照试验或半随机对照试验,评价纳入研究的方法学质量,并提取有效数据用RevMan5.0.软件进行Meta分析。结果与结论:纳入6个研究,包括4个随机对照试验和2个半随机对照试验,共486例患者,1099个周期(优选精子的次数)。Meta分析结果显示,上游法与梯度离心法相比,周期妊娠率[OR=1.11,95%CI(0.8,1.55)]、流产率[OR=0.31,95%CI(0.09,1.04)]、精子密度[WMD=-0.89,95%CI(-14.17,12.38)]、精子活力[WMD=-2.31,95%CI(-7.27,2.65)],4项测量指标差异均无显著性意义。尽管与其他精子优选法相比,上游法与梯度离心法的周期妊娠率较高,但是该系统评价结果还不能提示这两种方法在宫腔内人工授精应用中何者临床效果更好。建议今后进行更多高质量的随机双盲对照试验为临床提供最佳证据,并且增加处理前后精子的质量对比,包括精子活力、精子密度以及精子功能等指标测量,以全面考察两种方法的优劣。

密度梯度离心加上游法处理对精子形态学的影响

目的观察男性精液经密度梯度离心加上游法处理前、后精子形态学改变情况,探讨密度梯度离心加上游法对精子形态学的影响。方法选择行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕治疗的93对不孕夫妇,男方精液在经密度梯度离心加上游法处理前、后分别进行精液常规检查,运用Diff-Quick精子形态分析法进行精子形态学分析。结果经密度梯度离心加上游法处理后正常形态精子率显著增加,中段畸形精子率、混合畸形精子率与处理前比较有明显下降(P<0.05)。结论经密度梯度离心加上游法处理可降低中段畸形精子率和混合畸形精子率,显著提高正常形态精子率。

蔗糖密度梯度离心技术纯化山羊痘病毒的研究

为了提纯细胞培养物中的山羊痘病毒（Goat pox virus,GTPV）,试验采用低速离心法去除大部分细胞碎片,之后加入聚乙二醇6000（PEG6000）沉淀病毒,用蔗糖密度梯度离心技术进行纯化,然后用双抗体夹心ELISA和电镜观察法对纯化的病毒进行检测。结果表明：病毒得到有效富集,电镜观察可见完整病毒颗粒且背景清晰。说明蔗糖密度梯度离心技术可以有效纯化细胞培养物中的GTPV,且能保留其免疫原性。