Simultaneous determination of seven caffeoylquinic acids and three flavonoids in Pyrrosia petiolosa(Christ) Ching by RP-UFLC-DAD

An efficient, sensitive, accurate and rapid analytical ultra-fast liquid chromatography （UFLC） method for quality evaluations ofPyrrosia petiolosa （Christ） Ching from 20 regions of China was developed in this study. Ten marker compounds were simultaneously quantified, including 5-caffeoylquinic acid （5-CQA）, 3-caffeoylquinic acid （3-CQA）, 4-caffeoylquinic acid （4-CQA）, 1-caffeoylquinic acid （1-CQA）, 3,5-dicaffeoylquinic acid （3,5-diCQA）, 4,5-dicaffeoylquinic acid （4,5-diCQA）, 3,4-dicaffeoylquinic acid （3,4-diCQA）, astragalin, kaempferol-3,7-di-O-glucoside and （±）eriodictyol-7-O-β-D-glucuronide. Chromatography was performed on a Kromasil 100-2.5C18 （100 mm×2.1 mm, 2.5 μm） C18 column with gradient elution. The mobile phases consisted of 0.1% formic acid/water （A） and 0.1% formic acid/methanol （B）. The detection wavelength was set at 326 nm and the flow rate was 0.4 mL/min. Ten components were separated well with good linearity （r2〉0.9998）, precision, repeatability, stability. The recovery was in the range of 99.08%-102.77%. The results showed that the content determination using RP-UFLC-DAD fingerprint technique provides an efficient, sensitive, accurate and rapid analytical method for quality assessment ofP. petiolosa （Christ） Ching. Cluster analysis and principal components analysis were successfully applied to analyze 20 samples, the results revealed that the method was efficient and authentic to distinguish producing areas and the source of P. petiolosa （Christ） Ching. Keywords： Pyrrosiapetiolosa （Christ） Ching, Caffeoylquinic acids, Flavonoids, Multicomponent determination, UFLC

黔产有柄石韦中硒元素含量对T淋巴细胞增殖的影响

有柄石韦具有显著的淋巴细胞增殖促进作用,但有效成分并不明确。课题组推测硒元素可能是有柄石韦T淋巴细胞增殖作用的有效成分之一,计划对贵州不同产地九批次有柄石韦进行硒元素含量检测并测试其提取物对H9淋巴细胞增殖效果。实验发现,贵州各产地有柄石韦硒元素含量在1.8~4.0μg/L之间,所有批次有柄石韦提取物对H9淋巴细胞均具有增殖促进作用且增殖率在120%~165%之间,两者Pearson相关系数为0.999,具有显著相关性。因此,硒元素是黔产有柄石韦淋巴细胞增殖作用的有效成分之一。

HPLC法同时测定有柄石韦中6种有效成分的含量

建立了高效液相色谱法同时测定有柄石韦中原儿茶酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及芦丁6个主要成分含量的方法。采用Sino Chrom ODS-BP C18(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱,以质量分数0.1%磷酸(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱,流速1.0 m L/min,检测波长320 nm,柱温25℃。结果表明,6种成分线性关系良好(R≥0.999 2,n=5),且分离度较好,平均加样回收率相对标准偏差均小于5%。该方法快速、简便、准确,为药用植物有柄石韦的定量检测和质量控制提供了实验依据。

有柄石韦中多糖提取工艺的优化

通过正交试验对有柄石韦中多糖提取工艺进行研究,为有柄石韦的深入开发利用提供基础材料。以多糖得率为指标,通过单因素和正交试验,对有柄石韦中多糖提取的工艺参数进行优化。超声时间、超声温度、料液比、水浴温度在多糖提取中影响因素的大小顺序为:提取时间>温度>料液比。有柄石韦中多糖提取最佳工艺参数组合为:超声温度40℃,提取时间60 min,料水比1∶8 g/mL,水浴时间130 min。以苯酚-硫酸法测定有柄石韦中多糖的提取率,方法可行,稳定。

有柄石韦中绿原酸的提取工艺优化

通过单因素和正交试验,以绿原酸提取率为指标,对有柄石韦中绿原酸提取的工艺参数进行优化,为有柄石韦的深入开发利用提供基础材料。有柄石韦中绿原酸提取最佳工艺参数组合为:料液比1∶13 g·mL-1,浸渍时间50 min,超声温度80℃,超声时间20 min。以紫外-可见分光光度法测定有柄石韦中绿原酸的提取率,方法可行,结果稳定。

HPLC法测定有柄石韦及华北石韦中绿原酸和木犀草素的含量及不同浸提物的指纹图谱分析

目的:通过HPLC法对有柄石韦及华北石韦中绿原酸和木犀草素含量的测定,以控制石韦药材质量,建立石韦药材中绿原酸及木犀草素的含量测定方法,同时对有柄石韦及华北石韦中绿原酸及木犀草素的含量进行比较以及对不同浸提物的指纹图谱进行分析。方法:用hypersil ODS-2柱,流动相为乙腈-0.5%磷酸水(9∶91),检测波长326 nm,流速1 m L·min-1。结果:各峰可较好的分离,有柄石韦中绿原酸的含量可达到1.51%。结论:该方法操作简便,结果准确,具有较好的重现性与稳定性,可用于有柄石韦及华北石韦中绿原酸和木犀草素含量测定。

有柄石韦中黄酮类成分的分离纯化工艺的研究

通过正交试验对有柄石韦中黄酮类成分分离纯化工艺进行研究,为有柄石韦的深入开发利用提供基础材料。以黄酮得率为指标,通过单因素和正交试验,对有柄石韦中多糖提取的工艺参数进行优化。在黄酮纯化中影响因素的大小顺序为:萃取溶剂>萃取次数>溶剂用量>萃取时间。有柄石韦中黄酮分离纯化的最佳工艺参数组合为:萃取溶剂为正丁醇,萃取时间30 min,溶剂的量为200 mL,萃取4次。实验验证该工艺可行,稳定。

黔产有柄石韦利尿通淋有效部位化学成分研究

目的:研究黔产有柄石韦利尿通淋有效部位的化学成分。方法:采用硅胶、Sephadex LH-20、重结晶等方法进行分离纯化,通过理化性质、光谱数据结合参考文献鉴定化合物结构。结果:从黔产有柄石韦95%乙醇提取物的石油醚部位分离得到14个化合物,分别鉴定为:里白烯(1)、22-羟基何柏烷(2)、β-谷甾醇(3)、(22E)-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol(4)、坝巴酸(5)、环桉烯酮(6)、泽屋萜(7)、豆甾-4-烯-3-酮(8)、东北贯众醇(9)、hopan-28,22-olide(10)、齐墩果酸(11)、22,28-环氧何柏烷(12)、环何柏烯醇(13)、环桉烯醇(14)。结论:其中,化合物4、5、7、8、10为首次从石韦属植物中分离得到,化合物4、5、7~13为首次从该植物中分离得到,化合物13是首次在该植物中发现的C-28与C-29相连而多一个环的何柏烷型三萜。

有柄石韦乙酸乙酯部位化学成分研究

目的:研究有柄石韦的化学成分。方法:利用硅胶、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶、RP-C_(18)、PHPLC等柱色谱对有柄石韦进行分离纯化,利用波谱技术对化合物进行结构鉴定。结果:从有柄石韦乙酸乙酯部位分离得到15个化合物,分别鉴别为:对羟基苯丙酸甲酯(1)、6-O-[(9Z,12Z,15Z)-octadeca-9,12,15-trienoyl]-β-D-fructofuranosyl-α-D-glucopyranoside(2)、6′-O-亚油基蔗糖(3)、(2S)-2,3-O-双十八烷-9Z,12Z,15Z-三烯酰基甘油酯-6′-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷(4)、山柰酚-7-O-β-D-芹菜苷(5)、开环异落叶松脂醇(6)、异落叶松脂醇(7)、柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸(8)、圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖醛酸(9)、4,5-二咖啡酰基奎宁酸甲酯(10)、3,4-O-二咖啡酰基奎尼酸(11)、1,2-二咖啡酰-环戊基-3-醇(12)、没食子酸(13)、香草酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(14)、新绿原酸甲酯(15)。结论:其中,化合物1~8、10、12~15为首次从有柄石韦中分离得到。

黔产有柄石韦利尿通淋有效部位化学成分研究(Ⅱ)

目的:研究黔产有柄石韦Pyrrosia petiolosa(Christ)Ching利尿通淋有效部位的化学成分。方法:利用多种色谱技术对黔产有柄石韦95%乙醇提取物进行分离,并经NMR、MS等波谱方法进行鉴定。结果:从有柄石韦中分离得到15个化合物,分别鉴定为:木栓酮(1)、(23E)-cycloart-23-ene-3β,25-diol(2)、(23E)-cycloart-23,25-dien-3β-ol(3)、cyclolaudenol(4)、11-羰基-β-乙酰乳香酸(5)、cycloartenone(6)、乌苏酸(7)、β-谷甾醇棕榈酸酯(8)、normonisesquaterpenol(9)、蔗糖(10)、绿原酸甲酯(11)、β-胡萝卜苷(12)、柚皮素(13)、山柰酚(14)、2′,3′-dihydroxy propylpentadecanoate(15)。结论:其中,化合物1~6、8、9、15为首次从石韦属植物中分离得到。

有柄石韦正丁醇部位化学成分研究

目的:对有柄石韦正丁醇部分的化学成分进行研究。方法:利用硅胶、Sephadex LH-20凝胶、RP-C18、PHPLC等柱色谱方法对有柄石韦的正丁醇部位进行分离纯化,根据化合物的理化性质和MS、NMR等波谱数据方法进行结构鉴定。结果:从有柄石韦中分离纯化得到15个化合物,分别鉴定为:原儿茶酸(1)、七叶内酯(2)、绿原酸甲酯(3)、香草酸(4)、儿茶素(5)、表儿茶素(6)、4-O-咖啡酰基奎宁酸甲酯(7)、5-甲氧基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基苯甲酸甲酯(8)、4β-carboxymethyl-(-)-epicatechin methyl ester(9)、咖啡酸(10)、咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(11)、儿茶素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(12)、二氢柏松苷(13)、3-O-feruloglsucrose(14)、八角枫苷A(15)。结论:其中,化合物1、2、5~8、12~15为首次从石韦属植物中分离得到,化合物11为首次从有柄石韦中分离得到。

黔产有柄石韦利尿通淋有效部位化学成分研究(Ⅲ)

目的:研究黔产有柄石韦Pyrrosia petiolosa(Christ)Ching利尿通淋有效部位的化学成分。方法:利用多种色谱技术对黔产有柄石韦95%乙醇提取物进行分离,并经NMR、MS等波谱方法进行鉴定。结果:从有柄石韦中分离纯化得到16个化合物,分别鉴定为:环桉烯醇(1)、10-eicosenoic acid(2)、methyl indomethacin(3)、1-乙酰氧基-4-乙氧基苯(4)、正十六酸甲酯(5)、β-谷甾醇(6)、1-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-2-O-hexadecanoylglycerol(7)、n-pentadecanylocta-dec-19-en-oate(8)、prednisone methyl ester(9)、棕榈酸(10)、圣草酚(11)、正二十六烷(12)、ethylene terephthalate cyclic trimer(13)、油酸酰胺(14)、bis(2-ethylhexyl)benzene-1,2-dicarboxylate(15)、圣草酚-7-O-β-D-(6″-甲酯基)-吡喃葡萄糖醛酸苷(16)。结论:除了化合物1、6、10、11、12、14外,其他化合物均为首次从石韦属植物中分离得到。

有柄石韦的化学及药理研究进展

有柄石韦为水龙骨科石韦属植物,是传统药用植物之一。目前国内外对有柄石韦的相关研究较少。本文就有柄石韦的化学及药理研究进行综述,以期为有柄石韦的深入研究和临床应用提供更多理论依据。

有柄石韦药材UPLC特征图谱研究

目的建立有柄石韦药材的UPLC特征图谱,为有柄石韦药材的质量控制和评价提供依据。方法采用Waters CORTECS T3(100 mm×2.1 mm,1.6μm)色谱柱;以甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相,梯度洗脱;流速为0.38 mL/min;检测波长为326 nm;柱温为30℃;进样体积为1μL。结果首次建立有柄石韦药材的UPLC特征图谱,运用相似度评价软件标定9个共有峰,其中5个色谱峰经指认为新绿原酸、咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C;20批有柄石韦相似度大于0.98;聚类分析结果欧氏距离平方和为5时,20批有柄石韦药材可分为4类,基本与产地相符;特征图谱可以初步区分石韦的3个基源及伪品华北石韦。结论本研究为鉴别有柄石韦药材提供了一种操作简单、快速、重复性好的方法,为有柄石韦药材的质量控制提供一定的参考。

基于NaCl重吸收抑制作用的石韦利尿活性成分筛选

目的建立基于抑制NaCl重吸收作用的利尿药物体外筛选模型,研究21个从石韦中分离的化合物的利尿活性,并通过体内实验进行验证。方法采用犬肾小管上皮细胞MDCK对石韦中21个化合物进行体外利尿活性筛选,确定NaCl体外转运实验的最佳NaCl剂量;将MDCK细胞接种于Transwell小室内,设置对照组、石韦化合物(100μmol/L)组、氢氯噻嗪(100μmol/L)组,给药孵育24 h后,加入NaCl溶液(15 mg/mL),于30 min、2 h、4 h分别取Transwell下室培养液,检测Cl-和Na+吸光度。昆明小鼠随机分为对照组、绿原酸甲酯(10 mg/kg)组、山柰酚(10 mg/kg)组、氢氯噻嗪(10 mg/kg)组,给予药物干预5 d后,检测各组小鼠5 h内的尿量。结果与对照组比较,加入NaCl 30 min,氢氯噻嗪组MDCK细胞Cl-和Na+水平显著降低(P<0.05),绿原酸甲酯组MDCK细胞Na+水平显著降低(P<0.05);加入NaCl 2h,绿原酸甲酯组MDCK细胞Cl-水平显著降低(P<0.05)。与对照组比较,绿原酸甲酯组和氢氯噻嗪组小鼠给药后5 h内的总尿量显著增加(P<0.05);氢氯噻嗪组和绿原酸甲酯组小鼠尿量峰值分别为给药后1.5、2.5h,随后尿量均呈下降趋势。结论绿原酸甲酯可抑制肾小管氯化钠转运,对小鼠具有利尿作用,是石韦中的利尿活性成分。

有柄石韦中二氢黄酮类和咖啡酰奎宁酸类5个成分的同时测定

目的:建立同时测定有柄石韦中1个二氢黄酮类成分(圣草酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷)及4个咖啡酰奎宁酸类成分(绿原酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸甲酯、3,4-二咖啡酰奎宁酸、1,2-二咖啡酰-环戊基-3-醇)含量的高效液相色谱法。方法:采用SHIMADZU C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL·min^(-1),检测波长为330 nm,柱温30℃。结果:绿原酸、圣草酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸甲酯、3,4-二咖啡酰奎宁酸、1,2-二咖啡酰-环戊基-3-醇进样量分别在0.1066~2.6655μg(r=1.0000)、0.1602~4.0060μg(r=1.0000)、0.0065~0.1625μg(r=1.0000)、0.0069~0.1715μg(r=1.0000)和0.0096~0.2390μg(r=1.0000)范围内与峰面积呈现良好的线性关系;精密度(RSD≤0.7%)、稳定性(RSD≤0.4%)良好;平均回收率(n=6)分别为101.5%、100.4%、99.7%、97.3%和101.2%,RSD分别为0.21%、0.52%、0.57%、0.92%和1.0%;4批样品中绿原酸、圣草酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸甲酯、3,4-二咖啡酰奎宁酸和1,2-二咖啡酰-环戊基-3-醇含量范围分别为2.186~7.405、7.694~10.790、0.352~0.511、0.332~0.512和0.437~0.763 mg·g^(-1)。结论:该方法简便易行,重复性好,可作为有柄石韦药材的质量控制指标。

有柄石韦中坝巴酸的通淋作用研究

目的研究黔产有柄石韦Pyrrosia petiolosa中坝巴酸的通淋作用。方法犬肾小管上皮细胞(MDCK)给予100μmol/L坝巴酸孵育24 h,MTT法检测坝巴酸对MDCK细胞活力以及脂多糖诱导的MDCK炎症模型细胞活力的影响。雄性昆明种小鼠随机分为正常组、模型组及坝巴酸低、高剂量(10、20 mg/kg)组和肾石通(4.5 g/kg)组,除正常组外,其余各组每日ig 1%乙二醇和1%NH_(4)Cl连续造模30 d,造模同时ig药物,末次给药后取小鼠尿液和肾脏,采用苏木素-伊红(HE)染色法检测肾组织病理变化;采用钙离子检测试剂盒检测尿钙、肾钙含量。利用Auto Dock软件对坝巴酸和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARG)、WNK赖氨酸缺乏蛋白激酶1(WNK lysine deficient protein kinase 1,WNK1)、钙感应受体(calcium sensing receptor,CASR)、细胞色素P450家族24亚家族A成员1(cytochrome P450 family 24 subfamily A member 1,CYP24A1)蛋白进行分子对接并分析对接结果。结果体外实验结果显示,与正常组相比,100μmol/L坝巴酸对MDCK细胞活力无明显影响;在30 mg/mL脂多糖诱导的炎症细胞模型中,坝巴酸可以显著提高MDCK细胞活力(P<0.05)。体内实验结果显示,各给药组小鼠肾组织炎性细胞浸润得到改善,肾组织损伤评分显著降低(P<0.05);坝巴酸低剂量组和肾石通组小鼠肾钙含量较模型组显著降低(P<0.05),尿钙含量显著升高(P<0.05)。分子对接结果显示,PPARG、WNK1、CASR、CYP24A1蛋白与坝巴酸的分子对接能均小于-21 kJ/mol,对接效果均较好。结论黔产有柄石韦中坝巴酸具有较好的抗炎、抑制肾钙蓄积的作用,其通淋活性机制与PPARG、WNK1、CASR、CYP24A1蛋白的结合活性有关。