丙酮酸甲酸裂解酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及酶学性质的研究

丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvateformate-lyase,PFL)是厌氧或兼性厌氧微生物中,代谢途径的关键酶之一,为了进一步研究其功能,我们以大肠杆菌JM109菌株基因组DNA为模板,进行PCR扩增大肠杆菌中的pfl基因。为测序方便将所得DNA片段连接到pMD18-T载体上,将测序正确后的pfl基因连接到表达载体pET-22b(+)中,重组表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过SDS-PAGE电泳分析,在分子量为85kDa处出现新生的蛋白条带。利用金属亲和层析对添加了6×组氨酸标签的PFL进行纯化,对PFL的酶学性质进行了研究。结果表明此酶的最适温度为35℃,最适pH为7.5,米氏常数Km=2.3mmol,Tm=49.9℃。