甘肃腐霉新记录种Pythium carolinianum的分离鉴定及rDNA-ITS序列分析

将诱饵法与组织分离法相结合,对甘肃中部干旱地区菜豆根围土壤中的腐霉菌进行分离,共得到6株腐霉菌株.通过挑单菌丝的方法获得纯培养菌系,在对纯化菌株形态特征、培养特性、生长速度和温度的适应范围研究的基础上,对编号为18-51 D的腐霉菌株培养后提取DNA,采用真核生物核糖体基因(rDNA)转录间隔区(ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增;扩增产物直接测序并输出全序列,获得947 bp的序列;将该序列在GenBank中进行比对,用DNAStar分析软件将同源性较高的登记菌株的序列与18-51D腐霉菌株用邻接法构建系统发育树,结果发现18-51 D与菌株DQ211524(Pythium carolinianum)和AY987038(P.carolinianum)聚为一类.依据形态学特征和分子鉴定,将这6株腐霉菌株鉴定为卡地腐霉P.carolinia num.这是第一次在菜豆根围土壤和在甘肃分离到卡地腐霉P.carolinianum,为甘肃腐霉新记录种.用平皿法测定该菌种对三科九种栽培植物的致病性,发现所有供试植物的胚根仅部分有轻微褐变,未见对生长有明显影响,说明P.carolinianum对这些植物基本无致病性.

用锅柄聚合酶链反应法克隆卡地腐霉Pr1基因的未知片段(英文)

目的:分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知片段的3′端未知序列。方法:采用 PANHANDLEPCR,以基因组DNA为模板,通过链内退火及延伸形成一个类似锅柄形状的结构,经嵌套式PCR 扩增得到未知目的片段。通过已知cDNA片段设计引物,PCR扩增得到该蛋白酶部分基因组序列,采用限制性 内切酶BamHⅠ消化卡地腐霉基因组DNA,经去磷酸化处理后,在消化片段3′端连接一段与卡地腐霉类枯草杆 菌蛋白酶基因5′端已知序列互补的5′端磷酸化寡核苷酸链NA,经链内退火及聚合酶延伸形成一锅柄状结构。 结果:获得一大小为876bp的PCR产物,经序列分析验证,该panhandlePCR产物包含了已知卡地腐霉类枯草杆 菌蛋白酶基因3′端未知的853bp核苷酸序列。结论:这种特殊的PCR方法可以高度有效地克隆和鉴定已知片 段两侧的未知基因片段。

卡地腐霉Pr1蛋白酶miniDNA文库的构建及基因片段的克隆

目的: 在本实验室已克隆得到的灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因的部分序列的基础上,继续分离该基因的全基因组序列。方法:采用构建卡地腐霉mini基因组文库的方法,首先利用已知序列设计引物,克隆得到该蛋白酶基因的部分基因组序列;然后采用限制性内切酶XhoⅠ消化卡地腐霉基因组DNA,同时用该内切酶消化质粒pBluescriptSK( -),经去磷酸化后,将基因组酶切产物克隆到载体上并转化到大肠杆菌JM109中,构建mini基因组文库。利用载体上的通用引物和根据已知序列设计的引物,进行嵌套式PCR。结果:获得一780bp的PCR产物,经克隆、测序和分析为卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知序列一端301bp未知序列。结论:这种方法操作简便,实验周期短,能够特异地扩增与已知位点相邻的基因组DNA。

卡地腐霉Pr1蛋白酶cDNA片段的分离和克隆

目的 :分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉 (Pythiumcarolinianum)Pr1蛋白酶 (subtilisin likeprotease)的cDNA片段。方法 :用 1%的几丁质悬液诱导培养卡地腐霉菌丝 30h ,然后按下述流程操作 :抽提菌丝的总RNA ;逆转录合成cDNA第一链 ;根据Pr1的保守氨基酸序列设计合成一对简并引物 ,以cDNA第一链为模板 ,用MOPAC方法 (MixedoligonucleotidesprimedamplificationofcDNA)扩增cDNA ;将扩增产物纯化、连入pGEM T载体 ,转化大肠杆菌DH5α用于测序。结果 :所获片段中 ,1个 5 30bp的cDNA片段与枯草杆菌类蛋白酶基因有较高的相似性 ,尤其与真菌Aphanomycesastaci (卵菌纲、水霉目 )的Pr1在核苷酸序列及翻译得到的氨基酸序列水平有较高的相似性 ,分别为 5 9%和 4 9%。此序列已登录Genbank数据库 ,检索号 :AF4 990 0 6。P .car olinianum与A .astaciPr1部分cDNA序列的比对亦登录Genbank数据库 ,检索号 :AY0 94 976 ,AY0 94 977。结论 :这一DNA片段可能是卡地腐霉Pr1蛋白酶的一条cDNA片段。更进一步的工作是设法获得全长cDNA片段 ,并加以证实。

灭蚊真菌卡地腐霉产生游动孢子所需条件的研究

目的:观察卡地腐霉产生游动孢子所需的环境条件。方法:以卡地腐霉经诱导产生的游动孢子数量为指标,观察不同条件对其产生游动孢子的影响,确定该真菌产生游动孢子所需的最适条件。结果:卡地腐霉产生游动包子的适宜温度范围为10～30℃,最适温度为 24～26％;适宜产孢的蒸馏水pH值范围为5～12,最适pH值为9～11;8 d的培养物产孢量最多;菌块与蒸馏水的比例为1:40时产孢最多;三种光照周期对卡地腐霉的产孢影响不大,紫外线对产孢有抑制作用;NaCl、(NH_4)_2SO_4、蛋白胨和葡萄糖对游动孢子的产生有较强抑制作用,产孢能力对尿素的耐受性极大。结论:本观察所得资料对卡地腐霉的基础研究和应用都有重要价值。

灭蚊真菌-卡地腐霉蚊虫宿主范围初探

目的:调查和探讨灭蚊真菌-卡地腐霉的蚊虫宿主范围。方法:野外采集蚊幼虫标本,通过形态鉴定其种属,在实验室按标准化方法测定卡地腐霉对其感染能力。结果:野外5处采集蚊虫标本约600只,受感染蚊虫分属2属7种,加上原有调查资料,到目前为止,已知卡地腐霉的蚊虫宿主共3属12种,内含重要疾病媒介蚊虫3种。结论:本研究初步给出了卡地腐霉在常见蚊虫特别是媒介蚊虫中的灭蚊谱。

大链壶菌和卡地腐霉的Pr1和Pr2类蛋白酶的研究

目的 :证实灭蚊真菌大链壶菌和卡地腐霉经诱导可产生枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶 (Pr1)和胰蛋白酶类蛋白酶 (Pr2 )。方法 :采用特异性底物测定、X光胶片印迹试验、含底物的硝酸纤维薄膜试验等多种方法对蚊虫体壁类似物———几丁质诱导前后培养液中酶的活性进行检测和比较。结果 :大链壶菌和卡地腐霉均可产生Pr1和Pr2类蛋白酶。并且 ,经几丁质诱导 30～ 6 0h后 ,卡地腐霉产生的Pr1和Pr2类蛋白酶及大链壶菌产生的Pr2类蛋白酶活性均明显增高。并通过对培养液进行冷冻干燥、等电聚焦电泳和脱盐等处理 ,对该蛋白酶进行了初步纯化。结论 :大链壶菌和卡地腐霉均可产生Pr1和Pr2类蛋白酶。几丁质对这些类蛋白酶的释放有诱导作用。