UHPLC Q-Exactive Plus Orbitrap HRMS法鉴定隔山消提取物在功能性消化不良大鼠体内代谢产物

目的建立UHPLC Q-Exactive Plus Orbitrap HRMS法鉴定隔山消提取物在功能性消化不良大鼠体内代谢产物。方法建立功能性消化不良大鼠模型。分析采用Hypersi 1 GOLD C_(18)色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.9μm);流动相水(含0.1%甲酸)-乙腈(含0.1%甲酸),梯度洗脱;体积流量0.3 mL/min;柱温40℃;电喷雾离子源;正负离子扫描。结果共鉴定出4种原型成分(白首乌二苯酮、去酰基萝藦苷元、青阳参苷元、丁香酸)及其110种代谢产物,其中粪便、尿液共有代谢产物12种,尿液特有代谢产物56种,粪便特有代谢产物42种。原型成分代谢途径包括Ⅰ相代谢(氧化、还原等)、Ⅱ相代谢(硫酸化、葡萄糖醛酸化等)及Ⅰ相、Ⅱ相复合反应。结论该方法高效全面,可为进一步寻找隔山消潜在活性代谢产物奠定基础。

蒙药朱日亨滴丸源头把控——基于Q-Exactive高分辨质谱结合指纹图谱技术的蒙药广枣药材质量评价研究

目的 运用Q-Exactive高分辨质谱结合指纹图谱评价不同批次广枣药材质量,为朱日亨滴丸源头把控提供参考。方法 采用Agilent ZORBAX ECLIPSE XDB-C18色谱柱,以0.1%甲酸水-甲醇梯度洗脱30 min,柱温为30℃,流速为1.0 mL/min。采用电喷雾(ESI)质谱离子源,在正离子与负离子模式下采集数据,检测范围为m/z100~1500。依据精确质量数以及二级碎片离子,结合标准物质及相关数据库信息,对蒙药广枣药材主要化学成分进行定性研究。同时测定10批广枣药材,应用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”建立广枣指纹图谱,并对各共有峰进行化学成分归属,对鞣花酸进行定量,评价各批次药材的质量。结果 鉴定出广枣中的37种化合物,并以鞣花酸为参照物,建立广枣药材指纹图谱,10批次广枣药材相似均在0.90以上。不同批次广枣药材鞣花酸含量差异明显。结论 建立基于Q-Exactive高分辨质谱结合指纹图谱技术的蒙药广枣药材质量评价研究方法为广枣药材质量控制提供参考,也为朱日亨滴丸源头保证提供科学依据。

UPLC-Q-Exactive-MS/MS测定伤痛宁胶囊中马兜铃酸Ⅰ的含量

目的建立UPLC-Q-Exactive-MS/MS测定伤痛宁胶囊中马兜铃酸Ⅰ的含量。方法采用Hypersil GOLD C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.9μm),流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L甲酸铵),梯度洗脱,流速0.5 mL/min,柱温30℃。采用电喷雾离子源正离子模式,进行平行反应监测模式,选择质荷比(m/z)359.0→298.0和359.0→296.0离子对进行监测。结果马兜铃酸Ⅰ在0.06~0.2 ng范围内线性关系良好(R2=0.9995),精密度和稳定性的RSD值均小于3%,加样回收率均值为104.1%(RSD=4.29%)。不同批次伤痛宁胶囊样品中马兜铃酸Ⅰ的含量均值为0.00000490%,从药材到成品的转移率均值为103.7%,RSD值为19.5%。结论该方法专属性好,灵敏度高,准确可靠、耐用,可以用于伤痛宁胶囊中马兜铃酸Ⅰ的含量测定。

基于UHPLC Q-Exactive Plus Orbitrap HRMS高分辨质谱技术的隔山消提取物化学成分分析

目的:采用UHPLC Q-Exactive Plus Orbitrap高分辨质谱(HRMS)技术建立全面、快速分析隔山消化学成分的方法,为隔山消的药效物质研究提供科学依据。方法:采用Hypersi 1 GOLD色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.9μm),以0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)为流动相进行梯度洗脱,流速0.3 mL·min^(-1),柱温40℃。在电喷雾离子源正、负离子模式下采集数据,扫描范围m/z 100~1500 Da;喷雾电压3.5 kV(+),2.5 kV(-);鞘气流速35 arb;辅助气流速10 arb;毛细管温度320℃;辅助加热器温度350℃。依据HRMS提供的准分子离子峰及碎片离子的精确分子质量信息,结合对照品比对,相关文献报道及m/z Cloud和PUBchem数据库比对二级质谱进行鉴定。结果:从隔山消提取物中共分析出66个化合物,包括C21甾体类34个,有机酸类13个,苯乙酮类5个,香豆素类4个,生物碱类4个和其他类6个化合物,其中18个化合物为首次在隔山消中报道。结论:该方法可对隔山消化学成分进行快速、准确、全面的定性分析,为今后进一步阐明其药效物质基础和质量控制提供科学依据。

基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS的桔梗汤治疗小鼠急性肺损伤的磷脂组学研究

采用基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS的脂质组学方法,分析脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的急性肺损伤(acute lung injury, ALI)模型小鼠的肺组织磷脂代谢的变化,观察桔梗汤对异常脂质的调节,探究桔梗汤对LPS诱导的ALI的调节作用。分别采集空白对照组、ALI模型组、地塞米松(阳性药)组、桔梗汤组小鼠的肺组织样本,实验方案经南京中医药大学实验动物伦理委员会批准实施,提取其脂质成分,采用UHPLC-Q-ExactiveOrbitrap/MS脂质组学技术研究各组肺组织磷脂的变化。LPS诱导的ALI小鼠磷脂出现代谢异常,具体表现为磷脂酰胆碱(PC)类脂质出现明显的上调,磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)等脂质出现代谢紊乱,桔梗汤对这些变化磷脂具有一定的回调作用。LPS诱导的ALI引起体内磷脂紊乱,桔梗汤对代谢紊乱的磷脂具有调控作用。

基于UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS^(n)和分子网络技术快速鉴定吴茱萸汤中化学成分

《伤寒论》名方吴茱萸汤是首批《古代经典名方目录》收载品种,全方由吴茱萸、人参、生姜、大枣4味药组成,具有温中补虚、散寒降逆之功,临床应用广泛,疗效显著。经典名方化学组成是其物质基准和量值传递的重要前提,该研究旨在建立高分辨质谱(HR-MS)和分子网络整合的快速分析经典名方吴茱萸汤中化学成分的方法。采用AQUITY UPLC BEH C_(18)色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.7μm),以乙腈-0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱。分别在正、负离子模式下,采集Q-Exactive Orbitrap MS数据,根据MS/MS碎片模式的相似性创建GNPS分子网络,运用Cytoscape 3.6.1软件筛选结构相似的分子簇,最后根据对照品比对,并结合保留时间信息、高分辨质谱精确相对分子质量和MS/MS碎片信息对吴茱萸汤中化学成分进行快速准确鉴定。在吴茱萸汤中共鉴定出105种化学成分。该研究可为经典名方吴茱萸汤进一步的质量控制、基准物质研究以及药效物质研究等提供参考数据,同时也为中药化学成分的快速定性分析提供借鉴。

基于HPLC-Q-Exactive液质联用技术与HPLC的通脉降糖胶囊成分分析及指纹图谱研究

目的 开发一种基于HPLC-Q-Exactive液质联用技术的通脉降糖胶囊(Tongmai Jiangtang Capsule,TJC)全局定性分析的检测方法,同时应用液相色谱建立TJC的HPLC指纹图谱,并对其主要成分进行定量分析,为TJC的全面质量评价及质量控制提供参考依据。方法 利用Thermo Fisher Q-Exactive液质联用系统对TJC化学信息进行采集,结合数据库、文献检索及对照品比对等手段进行TJC成分鉴定。采用Capcell Pak C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,3μm),以0.5%甲酸水溶液-0.5%甲酸乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱,柱温40℃,体积流量0.4 mL/min,对15批次TJC样品进行检测,同时建立指纹图谱,应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)进行相似度评价和共有峰指认,并对其中8个指标成分进行定量测定。结果 利用高分辨液质联用技术共鉴定出TJC中150种化合物。15批TJC的指纹图谱相似度均在0.97以上,共标定25个共有峰,指认其中8个色谱峰(原儿茶酸、原儿茶醛、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、丹酚酸B以及丹参酮ⅡA),对其进行HPLC定量分析,结果显示所有目标成分均线性良好(R~2>0.999),平均回收率均在95.30%~103.56%,质量分数分别为原儿茶酸0.204~0.482 mg/g、原儿茶醛0.345~0.516 mg/g、葛根素5.374~8.805 mg/g、3′-甲氧基葛根素1.148~2.075 mg/g、葛根素芹菜糖苷1.327~2.204 mg/g、大豆苷1.378~2.276 mg/g、丹酚酸B 3.065~4.918 mg/g以及丹参酮ⅡA0.412~0.594 mg/g。结论 所建立的成分鉴定、指纹图谱和定量分析方法稳定可行、结果可靠,适用于TJC的综合质量评价,可为TJC产品的质量控制提供参考借鉴。

基于超高效液相色谱/四极杆-静电场轨道阱质谱联合网络药理学筛选“芩百清肺浓缩丸”治疗肺炎的活性成分

为筛选中药地龙在芩百清肺浓缩丸治疗肺炎时贡献的活性成分,本研究在开展细胞实验证实芩百清肺浓缩丸抗炎作用的基础上,采用超高效液相色谱/四极杆-静电场轨道阱质谱(UHPLC/Q-Exactive Orbitrap MS)法检测有、无地龙的芩百清肺浓缩丸提取液,借助Compound Discoverer软件筛选差异离子,根据二级质谱数据及标准品鉴定差异成分,进一步开展差异成分治疗肺炎的网络药理学研究,预测活性成分与靶点,并通过分子对接与实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)技术验证活性成分与靶点。结果表明,芩百清肺浓缩丸可通过降低细胞炎症因子IL6、IL-1b,趋化因子CXCL2和CXCR2的表达发挥抗炎活性,通过液相色谱-质谱筛选得到了15个差异成分,网络药理预测得到7个潜在活性成分及22个核心靶点,其中α-亚麻酸和腺苷经分子对接及RTqPCR实验验证为地龙在芩百清肺浓缩丸治疗肺炎时贡献的活性成分。该方法为筛选中药复方中组方药材贡献活性成分提供了参考,为中药复方活性成分研究提供了思路。

羊乳低聚糖超高效液相色谱-质谱鉴定中样品前处理方法及液相色谱条件优化

通过Sep-Pak C18与石墨化碳柱法、超滤法、透析法和葡萄糖凝胶层析法4种不同的前处理方法,以离子交换色谱法检测乳糖的去除率和低聚糖的损失率为评价指标,最终确定葡聚糖凝胶层析法为最优前处理方法。然后,采用超高效液相色谱-串联Q-Exactive Focus质谱对羊乳中的低聚糖进行分析及结构鉴定,以低聚糖的总离子流图为评价指标,对液相洗脱条件进行优化,最终优化条件为:0~20 min,95%~78%A(乙腈);20~35 min,78%~73%A;35~38 min,73~62%A;38~45 min,62%~50%A。结果显示,采用凝胶层析法前处理样品测得低聚糖种类显著高于未去除乳糖的样品,在最优液相色谱分离条件下,羊乳低聚糖中同分异构体得到较好分离,对羊乳中低聚糖的结构解析具有重要参考价值。

应用鸟枪法LC-MS/MS鉴定烟粉虱唾液蛋白

烟粉虱是一种刺吸式口器小型昆虫,每年对我国农业生产造成巨大危害。烟粉虱在取食植物时分泌多种唾液蛋白帮助其取食,同时唾液中的效应因子在调控植物防御反应过程中发挥重要作用。由于烟粉虱个体微小,唾液收集十分困难,有关其唾液蛋白的研究难以开展。本研究收集了3万头烟粉虱唾液,利用高精度Q-Exactive质谱,采用shotgun的方法首次鉴定了烟粉虱唾液中蛋白组分。应用双层膜收集装置收集到的烟粉虱唾液经浓缩等处理后其蛋白浓度约为1.698 g/L。唾液蛋白样品经胶内酶解、LC-MS/MS检测、序列分析,最终鉴定出42个烟粉虱唾液蛋白。功能分析表明烟粉虱唾液蛋白组分与蚜虫唾液蛋白组分具有一定的相似性,但多数蛋白为功能未知蛋白。通过质谱鉴定烟粉虱唾液蛋白组分为深入研究烟粉虱唾液蛋白的功能奠定了基础,有利于明确烟粉虱危害寄主植物的分子机制,为开发害虫防治新方法提供新思路。

帕金森病患者血浆蛋白质组学的初步分析及鉴定

目的分析帕金森病(PD)患者血浆蛋白质组学的变化并筛选PD临床诊断和干预相关的生物学标志物。方法选择2016年7月至2017年3月于新乡医学院第一附属医院神经内科就诊的PD患者33例,按照疾病分期将患者分为早期PD组(n=19)和晚期PD组(n=14);另选取同期36例健康体检者作为对照组。分别从3组受试者中随机选取6例受试者的血样进行蛋白质组学分析。利用高效液相色谱仪(HPLC)联合Q-Exactive质谱仪筛选出早期PD组、晚期PD组、对照组样本中的蛋白质表达谱,并统计差异表达的蛋白质分子。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测早期PD组、晚期PD组和对照组受试者血浆中载脂蛋白E(APOE)、过氧化物酶蛋白-2(PRDX-2)、补体成分7(C7)蛋白表达水平。结果早期PD组与对照组之间筛选出97个差异性表达的蛋白质分子,晚期PD组与对照组之间筛选出68个差异性表达的蛋白质分子。差异表达的蛋白质生物信息学分析结果显示,这些蛋白质功能主要与氧化应激反应、炎症反应、补体激活、神经突触再生等生物学过程密切相关。3组受试者血浆中C7蛋白水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。早期PD组、晚期PD组患者血浆中APOE、PRDX-2蛋白水平均低于对照组(P<0.05)。结论 PD患者血浆中的蛋白质表达发生改变,APOE和PRDX-2可能是早期诊断PD的生物学标志物。

豆制何首乌中异黄酮成分的检测及对BMSCs增殖的影响

目的采用Q Exactive Plus LC-MS/MS定性鉴定豆制何首乌中微量异黄酮类成分,建立豆制何首乌与清蒸何首乌的薄层色谱(TLC)鉴别方法,并考察大豆苷元、染料木素对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖作用。方法采用UPLC-Q-Exactive高性能四极杆母离子选择性与高分辨准确质量数(HR/AM)Orbitrap检测相结合的技术定性鉴定目标成分,选用色谱柱Phenomenex C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm Phenomenex公司,美国);流动相:乙腈(D)-0.1%甲酸水(A)梯度洗脱,质谱采用负离子监测模式、采用全扫描及二级质谱扫描的功能,对微量目标化学成分进行快速识别;使用硅胶GF254薄层板对豆制何首乌中黑豆异黄酮类成分进行定性鉴别;采用MTT法检测大豆苷元、染料木素对BMSCs的增殖作用。结果UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱技术,使用少量对照品快速分析鉴定出豆制何首乌中微量的目标成分,具有高效分离及高灵敏检测优势;TLC鉴别大豆苷元斑点特征明显,专属性强、重复性好,方法简便;染料木素对BMSCs具有抑制作用,大豆苷元具有促进BMSCs增殖的作用。结论豆制何首乌中可检测到异黄酮微量组分,其中大豆苷元为LC-MS与TLC较易检测成分,可作为TLC鉴别豆制何首乌与清蒸何首乌的特征成分,可能为豆制何首乌补血功效增强的药效物质基础之一,可作为其质量控制的指标成分。

四极杆-轨道阱高分辨质谱联用技术用于食品中罂粟壳特征成份的确证

采用液相色谱-四极杆/轨道阱高分辨质谱（Q-Exactive）技术,建立了火锅底料、食品调味料、烤肉、凉皮中吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁5种生物碱的确证方法。样品在稀盐酸溶液中超声提取,经三氯甲烷除脂,离子交换固相萃取柱净化,氨化甲醇-乙酸乙酯洗脱,Accucore a Q色谱柱分离,电喷雾模式下通过静电场轨道阱全扫描得到5种生物碱的准分子离子峰,同时设定阈值自动触发二级质谱进行定性确证,同位素内标法定量,实现了食品中罂粟壳主要特征成份的筛查,同时对5种生物碱的特征子离子裂解方式进行研究。在最佳实验条件下,5种生物碱的质谱扫描质量精度误差小于5 ppm。吗啡的定量下限（LOQ）为2.0μg/kg,可待因为0.2μg/kg,罂粟碱、蒂巴因和那可丁为0.1μg/kg。分析物浓度与对应峰面积呈良好的线性关系（r2〉0.999）,方法回收率为63.4%~112.8%,相对标准偏差（RSD）为5.5%~13.6%。将该方法应用于多种实际样品分析,其定量结果准确,定性可靠。

基于序贯代谢的五味子入血及脑脊液成分分析

目的:基于序贯代谢方法,结合液质联用技术鉴定五味子入血和入脑脊液原型成分和代谢产物。方法:雄性SD大鼠在灌胃给药和在体肠灌流给药后收集其综合代谢、肠代谢、肝代谢血浆和脑脊液样品,利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法(UPLC Q-Exactive Orbitrap MS)分析并比对五味子提取液、空白血浆、含药血浆、空白脑脊液、含药脑脊液样品谱图差异,采用ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm),流动相乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)梯度洗脱(0~7 min,95%B;7~12 min,95%~35%B;12~17 min,35%~15%B;17~20 min,15%~12%B;20~22 min,12%~5%B;22~23 min,5%B;23~25 min,5%~95%B;25~28 min,95%B),加热电喷雾离子化源(HESI),正、负离子检测模式,扫描范围m/z 100~1500。根据化合物的保留时间、特征碎片、分子式及对照品信息鉴定五味子入血及脑脊液的原型成分和代谢产物。结果:从五味子提取物中共鉴定出42个化学成分,包含木脂素、黄酮、氨基酸、鞣质等化合物,其中以木脂素类化合物为主。从不同部位获取的血浆样品中共鉴定出27种原型入血成分与14种代谢产物;在脑脊液中共鉴定出15种原型成分和9种代谢产物;代谢产物生成过程中涉及的代谢反应主要有去甲基化、甲基化、去甲氧基化和羟基化等。结论:通过对五味子在大鼠体内的原型成分与代谢产物的系统鉴定,为后续更好地挖掘五味子中治疗中枢神经系统疾病的药效物质基础提供了数据支撑。

正心降脂片HPLC指纹图谱构建与共有峰高分辨质谱分析

目的:建立正心降脂片的HPLC指纹图谱,为该制剂的质量控制提供参考依据。方法:采用Kromasil C_(18)色谱柱(4.6 mm×150 mm,3.5μm)进行色谱分离,使用乙腈-0.1%甲酸流动相系统进行梯度洗脱,流速0.8 mL·min^(-1),柱温25℃,检测波长254 nm。采用国家药典委员会颁发的中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)分析评价所构建的10批正心降脂片指纹图谱相似度。采用Q-Exactive轨道阱高分辨质谱技术和对照品比对鉴定共有峰成分。结果:构建了正心降脂片的指纹图谱共有模式并确认了其中的32个共有指纹峰,去除芦丁积分前后计算得到的10批正心降脂片指纹图谱与对照指纹图谱的相似度分别大于0.99和0.95。采用高分辨质谱技术共鉴定了26个共有峰,其中13个共有峰采用对照品比对进一步确认为3’-羟基葛根素、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芦丁、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、大豆苷元、丹酚酸A、槲皮素、异鼠李素、橙黄决明素、大黄素。通过与组方中各单味药以及阴性样品的比对,对共有峰进行峰归属,32个共有峰涵盖了组方中全部8味药材。结论:本文所建立的正心降脂片HPLC指纹图谱方法简便、可靠,专属性强,结合共有峰的高分辨质谱定性分析,为正心降脂片的质量评价及药效物质基础研究奠定了基础。

高效液相色谱串联静电轨道离子阱质谱筛查奶粉中16种磺胺类药物

建立了超高效液相色谱串联高分辨质谱Q-Exactive快速定性筛查婴幼儿奶粉中16种磺胺类药物残留的方法。2 g奶粉样品以6 mL乙腈和4 mL水为溶剂提取,均质震荡后,使用无水硫酸镁脱水,离心后取乙腈层用100 mg C18固相吸附剂净化,并采用针头式滤膜过滤进样。本方法以FullMS/AIF (数据非依赖模式)扫描样品信息,FullMS/ddms^2(数据依赖)模式建立包含保留时间、母离子质核比、碎片离子信息的磺胺药物的数据库,利用Tracefinder软件对样品中残留的磺胺类药物进行快速的定性和定量。结果表明,16种磺胺类药物在10,50,100μg/kg添加水平内,平均加标回收率为67%~116%,RSD为1. 8%~12%,在各自的考察浓度范围内线性关系良好,R> 0. 99。

异欧前胡素在大鼠体内代谢产物的UHPLC-HRMS鉴定分析

目的分析鉴定异欧前胡素在正常大鼠体内的代谢产物。方法大鼠灌胃给药后,收集正常组和给药组大鼠的血浆、尿液和粪便样本,并以固相萃取柱提纯生物样品。采用UHPLC-HRMS(Q-Exactive Orbitrap MS)高分辨质谱对生物样品进行分析,并对代谢产物筛选鉴定。结果在正、负离子模式下,根据所获得的精确分子质量、色谱保留行为、质谱裂解规律、特征碎片离子、对照品比对以及文献报道,最终分析鉴定了32个代谢产物。其代谢途径主要包括呋喃环开环、内酯水解、氧化、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化以及它们的复合反应。其中,葡萄糖醛酸化产物为首次发现。结论本研究较为全面地阐明了异欧前胡素在正常大鼠体内的代谢转化情况,可为其进一步的药效学研究提供依据,并为呋喃香豆素类物质的代谢产物分析提供借鉴。

在线固相萃取/高分辨质谱快速分析三文鱼中氧氟沙星残留量

建立了液相色谱-四极杆/轨道阱高分辨质谱(Q-Exactive)技术测定三文鱼中氧氟沙星残留量的全自动分析方法。样品经Cyclone在线固相萃取柱在3 mL/min涡流下富集,乙腈-0.1%甲酸溶液(6:4)洗脱,采用CAPCELL MGⅡ液相色谱柱(150 mm×2.0 mm)分离,电喷雾模式下通过静电场轨道阱全扫描得到氧氟沙星的准分子离子峰,同时设定阈值自动触发二级质谱进行定性确证。在该实验条件下,氧氟沙星的质谱扫描质量准确度误差小于5 ppm,在1.0μg/kg^100μg/kg质量浓度范围内,目标物峰面积线性回归方程相关系数(R)≡0.9994,定量下限(LOQ)为2.0μg/kg;方法回收率为68.7%~102.4%,相对标准偏差(RSD)为6.7%~12.8%。将该方法应用于三文鱼实际样品分析时,定量准确,定性可靠。