羟基喜树碱对人胆管癌QBC939裸鼠移植瘤MMP-2、TIMP-2的影响

目的探讨羟基喜树碱对人胆管癌QBC939裸鼠移植瘤的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)的影响,分析MMP-2及TIMP-2与肿瘤发生、发展的关系。方法建立人胆管癌QBC939细胞株裸鼠皮下移植瘤模型,将24只裸鼠随机分成对照组、干预组和实验组,分析移植瘤体生长情况,免疫组化法结合图像分析系统半定量检测瘤体内MMP-2、TIMP-2及MMP-2/TIMP-2的比值。结果与对照组比,实验组可使移植瘤体的MMP-2、TIMP-2含量增高,后者差异有统计学意义(P<0.01);实验组可降低MMP-2/TIMP-2的比值和抑制移植瘤生长,差异有统计学意义(P<0.01)。结论实验组可降低移植瘤MMPV2/TIMP-2比值,对人胆管癌裸鼠移植瘤细胞外基质的降解可能具有抑制作用,进而抑制移植瘤的生长。

c-Met siRNA对肝细胞生长因子诱导的人胆管癌QBC939细胞增殖的影响

目的:近年来胆管癌的发病率和病死率呈上升的趋势,5年生存期低于5%,因此亟需利用现代生物技术探索新的治疗方法。探讨针对肝细胞生长因子(HGF)受体c-Met的RNA干扰对人胆管癌(CCA)QBC939细胞增殖的影响。方法:构建针对人c-Met基因的小干扰RNA(siRNA),转染体外培养的人CCA QBC939细胞,应用MTT法检测细胞增殖,Western blot检测c-Met、细胞周期素(Cyclin)D1和A表达以及磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和胞外信号调节激酶(ERK1/2)信号通路活化。结果:c-Met siRNA显著抑制c-Met蛋白表达,且随着其浓度的增加,c-Met蛋白表达逐渐下降,500 nmol/L c-Met siRNA对c-Met蛋白表达的抑制率达65%。HGF刺激24 h,细胞增殖是对照组的4.54倍,100 nmol/L c-Met siRNA预处理即显著抑制HGF诱导的细胞增殖,其抑制率达26%,且随浓度增加,其抑制作用逐渐增强,500 nmol/L c-Met siRNA对HGF诱导的细胞增殖的抑制率达85%。HGF刺激4h,PI3K和Akt的活性即显著增强,分别是对照组的4.09和4.54倍,c-Met siRNA可呈浓度依赖性的抑制HGF诱导的PI3K/Akt活化,500 nmol/L c-Met siRNA几乎完全抑制HGF诱导的PI3K/Akt活化。HGF显著诱导人CCAQBC939细胞ERK1/2活化,50 ng/ml HGF刺激4 h,磷酸化ERK1/2表达是对照组的3.63倍,c-Met siRNA可呈浓度依赖性的抑制HGF诱导的ERK1/2活化。HGF显著诱导人CCA QBC939细胞细胞周期素D1和A表达,分别是对照组的2.83和3.16倍,c-Met siRNA可呈浓度依赖性的抑制HGF诱导的细胞周期素D1和A表达。结论:针对人c-Met基因的RNA干扰可有效阻断人CCA QBC939细胞c-Met表达,并通过阻断PI3K/Akt和ERK1/2信号通路活化而抑制HGF诱导的细胞增殖。

羟基喜树碱对人胆管癌QBC939裸鼠移植瘤PS2、COX-2的影响

目的探讨羟基喜树碱对人胆管癌QBC939裸鼠移植瘤的乳癌相关肽(PS2)、环氧合酶-2(COX-2)的影响,分析PS2、COX-2与肿瘤发生、发展的关系。方法建立人胆管癌QBC939细胞株裸鼠皮下移植瘤模型,将30只裸鼠随机分成对照组、羟基喜树碱低剂量组和羟基喜树碱高剂量组,观察移植瘤体生长情况,RT-PCR法检测瘤体内PS2、COX-2 mRNA表达。结果与对照组比,羟基喜树碱低、高剂量组都可使移植瘤体的PS2 mRNA表达增高;COX-2 mRNA表达降低,且瘤体生长减慢,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论羟基喜树碱可降低移植瘤COX-2 mRNA表达,增高移植瘤体的PS2 mRNA表达,并使人胆管癌裸鼠移植瘤生长减慢。

大蒜素诱导人胆管癌细胞QBC939凋亡的实验研究

目的:观察大蒜素对人胆管癌细胞QBC939的作用。方法:MTT法检测大蒜素对QBC939细胞的抑制作用;光镜和电镜观察大蒜素作用后细胞形态的变化;流式细胞仪分析细胞周期的改变;凝胶电泳法检测细胞凋亡情况。结果:随着大蒜素作用时间的延长及浓度的增加,其对QBC939细胞的增殖抑制作用就越明显;流式细胞仪分析显示G2/M期阻滞和细胞凋亡;凝胶电泳示实验组DNA梯带(DNA ladder)形成。结论:大蒜素诱导的人胆管癌细胞的凋亡与细胞DNA分裂期阻滞密切相关。这一作用机制将为临床治疗提供理论依据。

体外转染PTEN抑制胆管癌QBC939细胞生长及下调mTOR表达的研究

目的研究信号转导通路PI3K/AKT/PTEN/mTOR中抑癌基因PTEN在体外对胆管癌QBC 9 3 9细胞生长的抑制作用,及对下游mTOR表达的影响。方法用携带有野生型PTEN和突变型PTEN的真核表达载体及空载质粒转染QBC 9 3 9;用W estern blot检测转染后PTEN蛋白的表达及蛋白激酶B磷酸化的变化;流式细胞技术检测细胞周期和细胞凋亡情况,及对下游mTOR表达的影响。结果野生型PTEN转染成功后的QBC 9 3 9细胞中PTEN明显上升,磷酸化AKT明显下降,mTOR表达也明显下调;而突变型PTEN转染后的细胞中PTEN上升,但磷酸化AKT的变化不明显,mTOR的表达亦无明显变化。结论PTEN通过磷酸化AKT使之活化,进一步使下游的mTOR同步下调,继而调节肿瘤细胞周期和细胞凋亡。在PI3K/AKT/PTEN/mTOR信号转导途径中,PTEN与mTOR通过AKT的磷酸化有密切关系。

UPR在人胆管癌细胞株QBC939中的作用

目的:研究UPR(未折叠蛋白反应,unfolded protein response)在QBc939细胞中的作用,为临床治疗胆管癌提供新思路。方法:低剂量过氧化氢(H_2O_2)、顺铂(DDP)作用于人胆管癌QBC939细胞系,MTT法测定不同处理组细胞生长曲线,westem-blot法测定不同处理组IRElα、BiP蛋白表达情况。结果:低剂量过氧化氢诱导QBc939增殖,顺铂抑制QBC939细胞增殖,IRE1α、BiP蛋白在过氧化氢组表达强阳性。结论:UPR促进细胞增殖,对细胞起保护作用,降低顺铂的抑制细胞作用。

原花青素对人胆管癌细胞QBC939抑制的体内外研究

目的研究原花青素(PC)体内外对人胆囊癌细胞的抑制作用。方法常规培养细胞,24 h后随机分为阳性对照组、空白对照组和PC组。MTT法检测PC对人胆囊癌细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期;建立QBC939细胞裸鼠异种移植瘤模型。将荷瘤裸鼠随机分为5组:阴性对照组、5-Fu阳性对照组及PC 3个剂量组,每日腹腔注射给药,每隔3 d测肿瘤大小;12 d后,处死裸鼠,剥瘤称重并计算抑瘤率。结果 PC 3个剂量组显著抑制QBC939细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性;将细胞周期阻滞在S期,并诱导QBC939细胞凋亡;PC可抑制QBC939细胞裸鼠异种移植瘤的生长。结论 PC体内外均可抑制SHG-44细胞生长,并诱导肿瘤细胞凋亡。

Src激酶特异性抑制剂PP2对人胆管癌QBC939细胞侵袭能力的影响和机制研究

目的探讨Src激酶特异性抑制剂PP2对人胆管癌QBC939细胞侵袭能力的影响和机制。方法通过Western Blot技术检测PP2对人胆管癌QBC939细胞中Src激酶活化的影响;用Transwell小室法观察PP2对QBC939细胞的影响;用RT-PCR和Western Blot技术检测PP2对QBC939细胞侵袭能力相关分子的作用。结果 PP2组中p-Src蛋白的表达水平明显低于对照组;PP2组QBC939细胞的体外侵袭能力较对照组显著降低;与对照组相比,PP2组E-cadherin的表达显著增强,CD44的表达则明显减弱。结论 PP2能通过抑制Src激酶的活化,增强QBC939细胞侵袭抑制分子E-cadherin、减弱促侵袭分子CD44的表达,进而抑制人胆管癌QBC939细胞的侵袭能力。

阿托伐他汀对人胆管癌QBC939细胞系侵袭的影响

目的探讨阿托伐他汀(ATV)对人胆管癌QBC939细胞系侵袭的影响及其可能作用机制。方法应用细胞培养技术培养人胆管癌QBC939细胞,经不同浓度的ATV处理后,以Matrigel侵袭实验和半定量RT-PCR检测ATV对QBC939细胞内Rho C mRNA表达的影响情况。结果 Matrigel侵袭实验显示,经10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L干预48 h后的QBC939细胞,随着浓度的增加,其体外侵袭能力明显减弱(P<0.01);半定量RT-PCR测定显示,ATV作用48 h后,QBC939细胞中Rho C的表达改变并不明显。结论 ATV可减弱人胆管癌QBC939细胞体外侵袭能力。

阿伐他汀诱导人胆管癌QBC939细胞凋亡的研究

目的观察阿伐他汀(ATV)对人胆管癌QBC939细胞增殖及凋亡的影响。方法应用细胞培养技术培养QBC939细胞,经不同浓度的阿伐他汀处理后,以MTT法检测QBC939细胞的存活率,通过光镜、倒置显微镜及琼脂糖凝胶电泳检测胆管癌细胞凋亡的形态学特征、生化学特征。结果在阿伐他汀的作用下,QBC939细胞的生长、增殖变的相对缓慢,凋亡的细胞出现膜小泡、凋亡小体等特征性改变;DNA电泳呈现典型的梯状条带。结论阿伐他汀可抑制胆管癌细胞的生长、增殖,并可诱导细胞发生凋亡,且其作用呈剂量效应关系。

LPS对5-FU杀伤QBC939细胞影响的实验研究

目的探讨LPS联合化疗药物5-FU对人胆管癌QBC939细胞生长和诱导细胞凋亡的影响。方法四甲基唾哇蓝(MTT)试验检测LPS对5-FU抑制QBC939细胞增殖的影响,流式细胞术观察LPS对5-FU诱导QBC939细胞凋亡的影响。结果 1MTT法检测显示5-FU对胆管癌细胞株QBC939杀伤作用明显,但易出现耐药性,LPS可以增强5-FU后期杀伤作用,能一定程度上防止耐药的出现;2流式细胞术结果显示化疗药物5-FU后能显著诱导QBC939细胞发生凋亡,凋亡指数为11.50±2.15(P<0.05),对照组为3.53±0.32,加用LPS后,能更明显地诱导凋亡,凋亡指数达到26.50±3.12,与单用加化疗药物5-FU比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LPS能增强5-FU对胆管癌细胞株QBC939的后期杀伤作用,LPS联合化疗药物可能是胆管癌临床治疗的一种合理策略。

RNA干扰ANXA5表达对人胆管癌细胞QBC939的增殖和侵袭的影响

目的:探讨膜联蛋白A5(ANXA5)对人胆管癌细胞QBC939增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法:构建3个沉默QBC939细胞ANXA5的shRNA质粒(ANXA5-sh1/2/3)和1个阴性对照质粒,慢病毒包装质粒后感染QBC939细胞,流式细胞仪检测感染效率。病毒感染QBC939细胞后,Western blotting检测细胞的ANXA5蛋白表达情况;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率变化;划痕实验和Transwell实验评估QBC939细胞迁移和侵袭能力的变化。结果:干扰组(KD)细胞中的ANXA5蛋白水平显著低于空白组(BC)和阴性对照组(NC)细胞中的ANXA5蛋白水平。与NC组和BC组细胞相比,KD组细胞中G0/1细胞的百分比和凋亡率增高,而细胞增殖活性降低。KD组细胞中的细胞迁移和侵袭能力也低于NC和BC组细胞。结论:RNA干扰QBC939细胞的ANXA5表达后,明显抑制其增殖、侵袭和诱导凋亡的作用。

RhoC基因对胆管癌细胞株QBC939细胞增殖和cyclinD1基因的影响

目的研究RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株的增殖及cyclinD1 mRNA表达的影响。方法将正、反义RhoC cDNA真核表达载体,转染人胆管癌细胞QBC939,检测细胞生长曲线,RT-PCR检测cyclinD1在QBC939细胞、转染空载体的QBC939细胞(QBC939-V)、转染正义RhoC的QBC939细胞(QBC939-S)、转染反义RhoC的QBC939细胞(QBC939-AS)的mRNA相对表达量。结果与QBC939及QBC939-V对照细胞相比,QBC939-S体外生长较快,QBC939-AS体外生长较慢,cyclinD1表达在QBC939-AS与对照组减少(P<0.05),cyclinD1表达在QBC939-S与对照组增加(P<0.05)。结论 RhoC可能通过调节cyclinD1来调控QBC939的增殖能力。

华蟾素对人胆管癌细胞QBC939抑制作用研究

目的观察华蟾素体内外对人胆囊癌QBC939细胞的抑制作用。方法常规培养细胞,24 h后随机分为空白对照组和华蟾素组6个剂量组,分别于3个时相采用MTT法检测华蟾素对人胆囊癌细胞增殖的抑制作用;建立QBC939细胞裸鼠异种移植瘤模型,随机分为阴性对照组、5-Fu阳性对照组及华蟾素3个剂量组,每日腹腔注射给药,观察荷瘤裸鼠的一般活动状况及进食量;12 d后处死裸鼠,剥瘤称重并计算抑瘤率;取血,ELISA法检测血清中细胞因子IL-6、TNF-α和sVCAM-1含量。结果华蟾素6个剂量组对QBC939细胞的增殖均具有抑制作用,与对照组比较差异有统计学意义,并且随着剂量的增加和时间的延长,抑制率也增加;华蟾素腹腔注射给药可改善荷瘤裸鼠的一般活动状况,增加进食量;抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生长,与对照组比较差异有统计学意义;提高血清TNF-α水平,降低IL-6和sVCAM-1水平,差异均有统计学意义。结论华蟾素体内外均可抑制胆囊癌QBC939细胞的生长,其体内抑瘤作用机制可能与上调裸鼠血清TNF-α细胞因子水平,下调IL-6和sVCAM-1水平有关。

三氧化二砷诱导人胆管癌细胞系QBC939凋亡的实验研究

目的 探讨三氧化二砷 (As2 O3 )对体外培养的QBC939细胞的生物学效应和作用机制。方法 MTT法检测As2 O3对QBC939细胞的增殖抑制作用 ,电子显微镜观察细胞超微结构改变 ,琼脂糖凝胶电泳测定DNAladder,流式细胞术检测细胞DNA含量 ,半定量RT PCR检测p5 3/bax/bcl 2mRNA的表达水平。结果 As2 O3 对QBC939细胞的增殖抑制作用随浓度升高和作用时间的延长而明显增强 ,并以 4 μmol/LAs2 O3 作用 96h抑制率达最高 (90 2 % ) ,流式细胞术显示正常生长的QBC939细胞自发性凋亡率为 2 94 % ,各实验组均出现程度不等的亚二倍体峰 ,并以 4 μmol/LAs2 O3 作用 96h凋亡率达最高 (87 7% ) ,透射电镜显示 1μmol/LAs2 O3 作用72h出现早期凋亡特征 ,4 μmol/L作用 4 8h出现典型凋亡特征 ;DNAladder测定显示随着浓度和时间的增加 ,ladder条带越来越明显 ;半定量RT PCR显示 4 μmol/LAs2 O3 作用 2 4、4 8、72h后显示bax上调和bcl 2的下调 ,p5 3则未检测到表达。结论 在体外As2 O3 能有效地抑制QBC939细胞增殖 ,诱导其凋亡 ,其机制可能与bax上调、bcl 2下调有关。

冬凌草甲素对胆管癌QBC939细胞增殖、凋亡及端粒酶活性的影响

目的探讨冬凌草甲素对胆管癌细胞系QBC939细胞增殖、凋亡及端粒酶活性的影响。方法采用不同浓度冬凌草甲素(0、10、20、40、80、100μmol/L)处理QBC939细胞24、48、72 h,MTT法测定QBC939细胞活力并计算增殖抑制率;不同浓度冬凌草甲素(0、20、40、80μmol/L)处理QBC939细胞48 h后,分别采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,Western Blot法检测QBC939细胞B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达,端粒酶重复序列扩增法检测QBC939细胞的端粒酶活性。结果 QBC939细胞增殖抑制率随冬凌草甲素的药物浓度升高、作用时间延长而升高;与0μmol/L冬凌草甲素组相比,其他浓度冬凌草甲素组的S期细胞比例降低;0、20、40、80μmol/L冬凌草甲素组QBC939细胞的凋亡率分别为0.5%、14.8%、25.8%及37.7%;Western Blot结果显示随着药物浓度的升高,QBC939细胞的Bax表达量逐渐升高,Bcl-2表达量逐渐降低;其他浓度冬凌草甲素组QBC939的端粒酶活性均低于0μmol/L冬凌草甲素组,且QBC939细胞的端粒酶活性随冬凌草甲素浓度的升高而降低(P<0.05)。结论冬凌草甲素可抑制QBC939细胞增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与抑制Bcl-2表达以降低端粒酶活性有关。

阻断NF-κB信号通路对人肝门部胆管癌细胞QBC939增殖的影响

目的:研究阻断NF-κB信号通路对人肝门部胆管癌细胞QBC939生长增殖的影响。方法:常规培养QBC939细胞,采用PDTC(100μmol/L)阻断NF-κB信号通路,Western blot检测核内P65蛋白水平的表达,CCK-8检测细胞生长增殖抑制率,流式细胞仪观察细胞周期与凋亡的变化情况。结果:经PDTC阻断NF-κB信号通路后,与对照组相比,细胞核内P65蛋白水平明显下降(P<0.05)。CCK-8检测显示细胞增殖活性明显受到抑制,并随时间的延长而愈渐明显,12、24、36h后细胞增殖抑制率分别为(22.53±0.03)%、(46.54±0.03)%、(58.02±0.03)%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测发现实验组G0/G1期细胞比例高于对照组,分别为(68.53±1.72)%、(38.3±1.35)%,差异有统计学意义(P<0.05);细胞凋亡率在实验组为(27.68±2.77)%,对照组仅为(9.27±2.36)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:阻断NF-κB信号通路诱导人肝门部胆管癌细胞G_0/G_1期阻滞及细胞凋亡,从而抑制细胞生长与增殖,提示NF-κB信号通路组成性激活参与人肝门部胆管癌的发生发展,以NF-κB信号通路作为治疗的靶点可能给人肝门部胆管癌带来新的治疗选择。

吉西他滨联合CIK细胞对胆管癌QBC939细胞的杀伤作用

目的:观察吉西他滨联合CIK细胞对胆管癌QBC939细胞的杀伤效应。方法:用健康人外周血单核细胞(PBMC)在体外用多种细胞因子诱导成CIK细胞,于培养14 d收获CIK细胞作为效应细胞,流式细胞术分析其表型特征。将不同效靶比的CIK细胞和不同浓度梯度的吉西他滨单独或联合作用于体外培养的人胆管癌QBC939细胞,于培养24 h及48 h后用CCK8法测定CIK细胞、吉西他滨及两者联合对胆管癌细胞的生长抑制率,用蛋白印迹法观察细胞凋亡相关蛋白Bax的表达。结果:CIK细胞体外培养14 d时,CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+HLA-DR+、CD3+CD56+、CD4+CD25+等双阳性细胞所占比例分别为10.89%、60.27%、71.82%、9.03%和4.01%;CIK及吉西他滨对人胆管癌QBC939细胞的抑制率随着效靶比和药物浓度的提高及作用时间的延长而提高(P<0.05)。而两者联合对人胆管癌QBC939细胞的杀伤作用明显高于单一因素。蛋白水平检测提示CIK细胞和吉西他滨均可使人胆管癌QBC939细胞的凋亡相关蛋白Bax表达上调,两者联合更为显著。结论:CIK细胞可通过诱导人胆管癌QBC939细胞凋亡发挥较强的杀伤作用。联合CIK治疗可明显增强吉西他滨对人胆管癌QBC939细胞的杀伤效应。

AMD3100对胆管癌CXCR4基因、蛋白表达及QBC939细胞增殖能力的影响

目的:探讨CXCR4基因在胆管癌组织标本及人胆管癌细胞株QBC939中的表达情况,分析AMD3100应用对CXCR4基因表达及QBC939细胞的生物学行为变化。方法:收集人胆管癌组织标本,培养人胆管癌细胞株QBC939,加入不同浓度的AMD3100抑制剂。采用RT-PCR和Western blot方法,分别检测人胆管癌标本及转染AMD3100抑制剂前后QBC939胆管癌细胞株中CXCR4基因和蛋白的表达。应用CCK-8试剂盒对转染后细胞增殖活性进行检测。通过克隆形成实验观察AMD3100对细胞克隆形成的抑制。结果:CXCR4基因及其蛋白在胆管癌组织标本及人胆管癌细胞株QBC939中均高度表达。不同浓度AMD3100抑制剂对QBC939胆管癌细胞株的增殖抑制活性取决于AMD3100抑制剂的孵育浓度、孵育时间。其中,转染不同浓度抑制剂24 h,并未对细胞增殖造成影响;转染48 h后,0.1μg·ml^(-1)AMD3100无明显影响,1μg·ml^(-1)、5μg·ml^(-1)的AMD3100抑制剂明显抑制了细胞的增殖;转染72 h后,各浓度均对细胞增殖有明显抑制作用。克隆形成实验分析显示,抑制CXCR4基因表达明显延长了克隆体形成时间,使克隆体体积和数目减少。结论:AMD3100抑制剂影响人胆管癌细胞株QBC939的增殖能力,抑制CXCR4基因和蛋白的表达。

蟾蜍灵对人胆管癌细胞QBC939增殖及cyclin E和P27蛋白表达影响的研究

目的已有诸多研究显示中药蟾蜍灵具有明显抑制肿瘤增殖的作用,观察蟾蜍灵对人胆管癌细胞QBC939的cyclin E和P27表达的影响,探讨其调控胆管癌细胞增殖的途径和机制。方法 MTT比色法观察不同浓度蟾蜍灵(0.1、1、10μmol/L)对人胆管癌细胞QBC939增殖的影响;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)实验检测蟾蜍灵毒性;流式细胞术检测人胆管癌细胞QBC939细胞周期的变化;Western blot法测定cyclin E、P27蛋白水平变化。结果 MTT比色法结果表明蟾蜍灵对人胆管癌细胞QBC939生长具有较强的抑制作用,并在一定范围内具有时间和浓度依赖性,流式细胞仪检测细胞周期阻滞在G0/G1期,具有良好的量效关系。Western blot测定cyclin E蛋白表达量下降,P27蛋白表达量升高。结论蟾蜍灵可能是通过阻滞细胞周期,减少cyclinE蛋白表达,增加P27蛋白表达,来达到抗肿瘤作用。