整合素连接激酶抑制剂QLT0267对TEMT过程中P38MAPK表达的影响

目的探讨在高糖诱导肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(TEMT)过程中,整合素连接激酶(ILK)抑制剂QLT0267对P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)表达的影响。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞(HK-2),分10组,每组给予不同浓度葡萄糖及QLT0267,干预48h。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,计算半数抑制浓度(IC50);随后选取对照组、高糖组、DMSO组、QLT0267(IC50)组(使用QLT0267后,HK-2细胞数量减少一半所需的QLT0267药物浓度),免疫荧光法检测各组ILK、P-P38MAPK的表达;Western blot检测各组ILK、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化-蛋白激酶B(P-AKT)、PP38MAPK、P38MAPK、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,观察各组表达差异性,探讨在TEMT过程中QLT0267对P38MAPK的影响。结果 30mmol/L的葡萄糖干预48h HK-2细胞增殖显著,同时上调细胞中ILK、P-AKT、P-P38MAPK、α-SMA的表达;QLT0267在抑制HK-2细胞增殖的同时,可以通过下调ILK下游P-AKT的表达,阻止P38MAPK活化,进而减少HK-2细胞中α-SMA的表达,延缓TEMT进程。结论 QLT0267可能通过部分阻止P38MAPK的活化,从而延缓HK-2细胞TEMT进程。

整合素连接激酶抑制剂QLT0267对肾小管上皮细胞转分化的影响

目的观察不同浓度整合素连接激酶(ILK)抑制剂QLT0267在高糖下诱导人近端肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(TEMT)的作用。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞,分为4组:对照组、高糖组、QLT0267组、高渗组,干预48h。逆转录聚合酶链式反应检测纤维粘连蛋白(FN)m RNA及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)m RNA的表达,Western blot检测ILK、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化-蛋白激酶B(P-AKT)及α-SMA的表达,比较组间差异,探讨QLT0267对近端TEMT过程的影响。结果 130 mmol/L高糖可以上调人近端肾小管上皮细胞细胞中ILK、P-AKT、FN、α-SMA的表达。230 mmol/L甘露醇不能引起人近端肾小管上皮细胞细胞中ILK、P-AKT、FN、α-SMA表达变化。310μmol/L QLT0267抑制高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞细胞AKT、FN及α-SMA的m RNA和蛋白表达。结论 130 mmol/L葡萄糖可以诱导人近端TEMT。2QLT0267通过抑制人近端肾小管上皮细胞细胞中ILK下游AKT的活化,进而抑制FN及α-SMA的表达,10μmol/L QLT0267可以抑制人近端TEMT。

QLT0267抑制整合素连接激酶对人皮肤成纤维细胞生物学特征的影响

目的观察不同浓度的QLT0267抑制整合素连接激酶(ILK)的活性对成纤维细胞(Fb)生物学特征的影响。方法收集整形手术后剩余的皮肤标本,采用机械法加酶消化法分离培养Fb,随机分为空白对照组、5 nM组、10 nM组、20 nM组、30 nM组、DMSO组,其中空白对照组常规培养不做任何处理,5 nM组、10 nM组、20 nM组、30 nM组按培养基中QLT0267浓度分别为5、10、20、30 nmol/L加入QLT0267溶液[二甲基亚酮(DMSO)为溶剂],DMSO组加入与30 nM组中QLT0267溶液同体积的DMSO,分组处理12、24、48、72 h后在倒置相差显微镜下观察细胞形态。CellTiter试剂盒检测分组处理24、48、72 h后各组Fb的增殖情况,并与空白对照组比较计算增殖抑制率;在48 h时间点,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况以及Western Blot法观察Fb表达磷酸化蛋白激酶B(pAKT)、总蛋白激酶B(tAKT)蛋白的变化。对数据进行LDS-t检验和重复测量设计方差分析检验。结果经浓度大于10 nmol/L的ILK特异性抑制剂作用下,Fb膨胀,细胞核固缩或破碎,并出现细胞凋亡,随QLT0267浓度的增高和刺激时间的延长,细胞形态的改变更加明显。CellTiter试剂盒检测结果显示10 nmol/L以上的QLT0267能明显抑制Fb的增殖,且随着QLT0267浓度的增高和刺激时间的延长,增殖抑制率也升高(F处理组=94.242,P<0.05;F时间=240.490,P<0.05;F处理与时间=11.551,P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示与对照组比较,10 nmol/L以上的ILK特异性抑制剂能诱导Fb凋亡,差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果显示在各组tAKT的表达组间差异无统计学意义(P>0.05)的前提下,不同浓度QLT0267组pAKT的表达比空白对照组低,并随着QLT0267浓度的上升而pAKT蛋白生成下降(P<0.05)。结论 10 nmol/L浓度以上ILK特异性抑制剂QLT0267能刺激Fb发生形态改变,抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。推测ILK可能通过影响Fb中pAKT的生成参与创面愈合过程的调控。

特异性整合素连接激酶抑制剂QLT0267对大鼠烧伤创面愈合影响的初步研究

目的观察局部注射特异性整合素连接激酶(ILK)抑制剂QLT0267对SD大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合影响,初步探讨ILK在创面愈合过程中的作用及机制。方法选取45只雄性SD大鼠,采用恒温恒压烫伤仪在其背部皮肤制备深Ⅱ度烧伤创面,并随机分成实验组、对照组及二甲基亚砜(DMSO)组,每组15只。实验组创面每天注射浓度100μM QLT0267液100μL;对照组创面每天注射0.9%氯化钠溶液100μL;DMSO组创面每天注射0.3%DMSO液100μL。测量各组大鼠创面愈合时间和愈合率;伤后14 d取材,各组随机选择5只大鼠,用SP法检测ILK、AKT、PAKT、α-SMA在创面组织中的表达,Western Blot检测各组ILK、AKT、PAKT蛋白含量;用Masson改良法检测创面胶原。结果实验组大鼠创面平均愈合时间为(21.1±0.6)d,比对照组(17.1±0.6)d和DMSO组(17.7±0.6)d长;实验组创面愈合率也低于对照组和DMSO组,比较差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot检测结果显示:各组ILK、AKT蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),实验组PAKT蛋白显著低于对照组和DMSO组。SP法结果各组ILK、AKT表达差异无统计学意义(P>0.05),实验组ILK活性被抑制,PAKT(0.406±0.008)表达较对照组(0.901±0.013)、DMSO组(0.966±0.011)降低,比较差异有统计学意义(F=11.27,P=0.04);实验组α-SMA表达(0.201±0.003)较对照组(0.339±0.006)、DMSO组(0.351±0.005)也降低,比较差异有统计学意义(F=52.86,P=0.001);实验组细胞外基质胶原排列较对照组、DMSO组明显稀疏、紊乱。结论 ILK活性被抑制时延迟大鼠皮肤创面愈合。ILK特异性抑制剂QLT0267通过抑制ILK活性PAKT合成减少,可能影响其下游信号的传导,导致肌成纤维细胞生成减少、胶原合成减少,影响创面愈合。

整合素连接激酶抑制剂对人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的探讨整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)抑制剂在人近端肾小管上皮细胞转分化中的作用及可能机制。方法对数生长期人近端肾小管上皮细胞(HK-2)随机分为对照组(无糖DMEM/F12培养液)、高糖组(30.0mmol/L葡萄糖DMEM/F12培养液)、抑制剂组(30.0 mmol/L葡萄糖DMEM/F12培养液+30.0μmol/L QLT0267 100μL),培养48h后,倒置相差显微镜下观察细胞形态,Western blot法检测HK-2细胞ILK、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(phosphorylated Akt,P-Akt)相对表达量,反转录PCR法检测ILK mRNA、纤连蛋白(fibronectin,Fn)mRNA表达量。结果对照组HK-2细胞呈椭圆形或圆形,细胞间连接紧密,呈岛屿状生长;高糖组细胞向长梭型转变,细胞间紧密连接消失,呈离散状生长;抑制剂组细胞改变同高糖组,但程度较轻;高糖组、抑制剂组HK-2细胞E-cadherin相对表达量(0.43±0.04、0.80±0.05)均低于对照组(1.04±0.05)(P<0.05),且高糖组低于抑制剂组(P<0.05);高糖组、抑制剂组P-Akt相对表达量(0.49±0.05、0.31±0.03)均高于对照组(0.21±0.01)(P<0.05);且高糖组高于抑制剂组(P<0.05),高糖组、抑制剂组HK-2细胞ILK相对表达量(0.52±0.02、0.51±0.02)均高于对照组(0.22±0.01)(P<0.05),高糖组与抑制剂组比较差异无统计学意义(P>0.05);高糖组、抑制剂组及对照组HK-2细胞Akt相对表达量(0.91±0.03、0.92±0.02、0.94±0.05)比较差异均无统计学意义(P>0.05);高糖组、抑制剂组HK-2细胞ILK mRNA(1.83±0.23、1.64±0.07)、Fn mRNA相对表达量(2.06±0.07、1.79±0.06)均高于对照组(0.83±0.04、1.14±0.08)(P<0.05),且高糖组Fn mRNA相对表达量高于抑制剂组(P<0.05),ILK mRNA相对表达量与抑制剂组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论ILK抑制剂QLT0267可抑制ILK下游效应分子Akt的磷酸化,减少Fn、E-cadherin下调,从而抑制或延缓肾小管上皮细胞转分化进程。