基于Qbeta噬菌体装甲RNA技术的诺如病毒RNA标准参考样品的研制

目的：针对目前检测领域缺乏诺如病毒（Norovirus,No V）核酸标准样品这一瓶颈,基于Qbeta噬菌体装甲RNA技术构建内含GII型No V检测靶标RNA的病毒样颗粒（virus like particles,VLPs）标准参考样品。方法：人工合成包含Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、ISO/T15216-2 2012中规定的GII型No V检测靶标对应的c DNA序列及辅助多克隆位点的DNA片段QINVGII,将其克隆到p ET-28a（＋）载体中,构建重组质粒p ET-QINVGII。将p ET-QINVGII转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞并诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和透射电镜分析后,利用氯化铯密度梯度离心,制备纯化VLPs,并对纯化后的VLPs开展均匀性、稳定性及定值研究。结果：SDS-PAGE结果证实重组大肠杆菌在14.1k Da左右有目的条带表达;透射电镜下可观察到大量结构完整、直径约为25nm的VLPs。定值结果显示,制备的VLPs样品中GII型No V检测靶标RNA的含量为（1.06±0.06）×107copies/μl;均匀性分析结果表明样品均匀性良好,即F=2.24< F0.05 ( 9 , 20 ) ；稳定性结果表明，制备的 VLPs 在 37 ℃ 可保存 12 天、室温（ 20 ~25 ℃ ）可保存 24 天、 4 ℃ 至少可保存 90 天、-20 ℃ 至少可保存 200 天、-80 ℃ 至少可保存 300 天。结论：基于 Qbeta 噬菌体制备的 NoV 装甲 RNA 均匀性和稳定性良好，拷贝数高，为 NOV 分子检测提供了良好的标准参考样品。