乾华肉用美利奴羊与小尾寒羊和乌珠穆羊的杂交效果分析

乾华肉用美利奴羊是我国自主培育的肉毛兼用型绵羊新品种,探究乾华肉用美利奴羊改良地方品种的生产性能,将对揭示该品种的种质特性和在肉羊主产区的示范推广提供充足的试验依据。在同一饲养条件下分别以乾华肉用美利奴羊和杜泊羊为父本,分别与小尾寒羊和乌珠穆沁羊两个地方品种进行杂交,对同龄后代的生长发育、屠宰性能和羊肉品质进行对比。结果表明:乾华肉用美利奴羊与两个地方品种的杂交后代从生长速度来看,均显著优于其他组合的杂交后代(P<0.05);从胴体重、屠宰率、净肉率、眼肌面积来看,6月龄和12月龄优于其他组合的同龄杂交羊(P<0.05);从羊肉剪切力和肌纤维直径来看,6月龄和12月龄显著低于杜泊与两个品种杂交后代(P<0.05)。综合比较生长发育、屠宰性能和肉质性状,乾华肉用美利羊与小尾寒羊的F_(1)代优于与乌珠穆沁羊的F_(1)代。分析饲养改良后代的经济收益发现,乾华肉用美利羊改良小尾寒羊、乌珠穆沁羊的后代分别较母本品种每只增加经济收益133.2~487.49元,较杜泊羊与两个地方品种杂交后代每只均增加100元以上。综上所述,乾华肉用美利奴羊改良小尾寒羊、乌珠穆沁羊等本地羊的效果良好,是发展肉羊产业的优良种源,可作为商品肉羊生产的父本品种而广泛利用。

miR-1-3p对乾华肉用美利奴羊次级毛囊发育相关基因的调控研究

为了探讨miR-1-3p及其靶基因与乾华肉用美利奴羊次级毛囊发生发育关系,该研究采集2周岁乾华肉用美利奴羊皮肤样品,利用生物信息学方法预测miR-1-3p的靶基因,荧光定量PCR检测miR-1-3p及其靶基因相对表达量,通过Western blot对miR-1-3p的靶基因成纤维细胞生长因子14(fibroblast growth factor 14,FGF 14)进行蛋白定量检测,并利用双荧光素酶报告基因试验验证miR-1-3p与候选靶基因的靶向关系。结果表明:通过Targetscan v7.0、miRanda和RNA223个靶基因预测软件确定FGF 14为miR-1-3p的候选靶基因;miR-1-3p在毛囊生长期低表达,在休止期高表达;FGF 14基因mRNA在毛囊生长期高表达,休止期低表达,与FGF 14蛋白表达规律一致。双荧光素酶报告基因试验结果表明miR-1-3p的靶基因为FGF 14。可见,乾华肉用美利奴羊次级毛囊miR-1-3p与FGF 14存在靶向调控关系,miR-1-3p可能是通过负调控FGF 14实现对乾华肉用美利奴羊次级毛囊发生发育进行调控。

乾华肉用美利奴羊次级毛囊小RNA文库构建及miR-1-3p靶基因预测

本试验旨在构建乾华肉用美利奴羊次级毛囊不同发育时期的小RNA文库和预测筛选miRNA的候选靶基因。通过高通量测序技术构建乾华肉用美利奴羊次级毛囊小RNA文库;采用荧光定量PCR对高通量测序结果进行验证;利用miRDeep2软件对miRNA(长度为20~24 nt的小RNA)进行鉴定;利用Targetscan v7.0、RNA22 v2.0和MiRanda三个在线靶基因预测软件对miR-1-3p的靶基因进行预测分析。成功获得乾华肉用美利奴羊次级毛囊生长期、退行期、休止期小RNA纯净reads分别为10279515、11712215和10926258。分别基于荧光定量与高通量测序的5个miRNA的相对表达量结果趋势基本一致。从次级毛囊生长期、退行期和休止期分别鉴定获得miRNA 1250、1304个和1266个。确定成纤维细胞生长因子14(FGF14)和类胰岛素生长因子Ⅰ受体(IGF1R)为miR-1-3p的候选靶基因。研究结果为后续靶基因验证及确定调控乾华肉用美利奴羊毛囊周期性发育的候选基因奠定基础。

乾华肉用美利奴羊新品种种质特性的研究

乾华肉用美利奴羊是正在培育的绵羊新品种,对该品种的产区的自然生态条件、品种体型外貌和生产性能指标进行观测和分析,旨在为进一步选育提高提供理论依据和技术参考。结果表明:乾华肉用美利奴羊对东北农牧交错区的自然条件具有良好的适应性;具有优良的生长发育性能、产肉性能、繁殖性能和产毛性能;该品种成年公、母羊的体重可达124.78、103.25 kg,原毛产量和净毛率分别为6.68 kg、49.15%,4.67 kg、48.83%;育成羊和成年羊的羊毛的自然长度均超过9 cm,体侧部的羊毛纤维直径集中在20.32~21.45μm;育成公、母羊的屠宰率和胴体净肉率分别为51.65%和75.45%、51.28%和74.251%;初产和经产母羊的产羔率分别为125.23%和150.21%,羔羊成活率分别为93.12%和95.26%。

POU1F1基因在乾华肉用美利奴羊不同部位肌肉表达的研究

垂体特异性转录因子(Pou1f1)与动物的生长发育密切相关,本研究运用免疫组化法、荧光定量PCR及Western Blot等方法对Pou1f1在乾华肉用美利奴羊的背最长肌、胸肌和半腱肌的转录和蛋白表达水平进行了检测,研究结果表明:POU1F1蛋白在乾华肉用美利奴羊背最长肌、胸肌、半腱肌中等3个不同肌肉组织的肌纤维细胞质中均有阳性表达;Pou1f1基因在乾华肉用美利奴羊背最长肌、胸肌、半腱肌等3个不同部位的不同肌肉的mRNA和蛋白水平均差异均不显著(P>0.05),但均呈现半腱肌>胸肌>背最长肌的趋势。说明Pou1f1基因可以作为肉羊生长发育特别是肌肉发育的遗传标记。

乾华肉用美利奴羊血液生化指标的测定与分析

乾华肉用美利奴羊是正在培育中的肉毛兼用型细毛羊新品种,探讨其不同年龄的血液生化指标变化,可为其选育与饲养管理提供参考依据。为此,本研究在其育种核心群中分别选择羔羊期、育成期和成年期3个不同阶段羊,测定其16项血液生化指标。结果表明:在不同年龄之间,乾华肉用美利奴羊羔羊血清中碱性磷酸酶活性极显著高于育成羊和成年羊(P<0.01);育成羊血清中白蛋白含量和白球比极显著高于羔羊和成年羊(P<0.01),血钠含量显著高于羔羊和成年羊(P<0.05);成年羊球蛋白含量显著高于羔羊和育成羊(P<0.05)。乾华肉用美利奴羊各项生化指标在成年羊性别间无显著性差异(P>0.05),其多种血液生化指标间均存在相关性。通过该试验可初步建立起乾华肉用美利奴羊血液生化指标的参考值,为今后乾华肉用美利奴羊的选育提高、饲养管理和疾病诊断等提供重要参考依据。

细毛羊皮肤毛囊miR-1298-5p的靶基因预测及验证

为探讨miR-1298-5p及其靶基因与细毛羊毛囊生长发育的关系,本实验以乾华肉用美利奴羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,通过生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RT-PCR和Western Blot对miR-1298-5p及其靶基因进行定量检测;扩增靶基因3'UTR区,构建野生型和突变型靶基因表达载体后与miR-1298-5p mimics共同转染到HEK293T/17细胞中,利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-1298-5p与靶基因的靶向关系。结果表明:FGF_2基因3'UTR区含有miR-1298-5p结合位点,FGF_2为miR-1298-5p潜在靶基因,通过核酸水平和蛋白水平定量表达规律发现miR-1298-5p与靶基因FGF_2呈负相关,初步确定FGF_2为miR-1298-5p的靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-1298-5p mimics能够抑制野生型FGF_2的靶位点报告载体的荧光素酶活性;但当靶基因结合位点突变后,FGF_2被抑制的荧光素酶活性能够得到恢复。综上,miR-1298-5p与FGF_2有靶向关系,miR-1298-5p能通过负调控FGF_2的表达调控羊毛囊发育。

乾华肉用美利奴羊体重与体尺指标的相关性分析

为探讨乾华肉用美利奴羊体尺指标与体重的相关性,更好地服务于该品种的选育工作,通过SPSS软件对120只乾华肉用美利奴羊的成年母羊体重、体尺进行了相关分析和通径分析,并建立了最优回归方程。结果表明:乾华肉用美利奴羊的体重(Y)与体高(X_1)、体斜长(X_2)、胸围(X_3)、尻宽(X_5)呈极显著正相关(P<0.01);胸围、体高和尻宽的直接作用和间接作用对体重的影响都极大,其体尺性状与体重的最优回归方程为Y=0.376X_1+0.397X_3+0.362X_5,决定系数(R_2)为0.704。

乾华肉用美利奴羊皮肤毛囊结构及周期性变化规律的研究

为了揭示绒毛生长不同时期乾华肉用美利奴羊皮肤毛囊结构与变化规律,进而为其毛囊发育的分子调控机制奠定组织学基础,本试验采用组织学方法,对乾华肉用美利奴羊绒毛生长的兴盛期、退行期、休止期毛囊结构及毛囊密度变化的差异进行比较研究。结果表明:不同时期的乾华肉用美利奴羊皮肤毛囊密度存在一定的差异,且各时期初级毛囊密度变化不明显(P>0.05),次级毛囊密度兴盛期最大(42.73±4.71个/mm^2),其次为退行期(32.53±3.32个/mm^2),休止期次级毛囊密度最小(28.21±2.79个/mm^2),且不同时期次级毛囊密度差异显著(P<0.05);绒毛生长兴盛期S/P值最大,退行期、休止期差异显著(P<0.05)。

乾华肉用美利奴羊的染色体核型研究及G-带分析

旨在研究新品种乾华肉用美利奴羊染色体的核型和G-带,揭示该品种的染色体数目和结构变异特征。采用外周血淋巴细胞培养法及常规染色体标本制备技术,分析染色体核型和G-带。结果表明,乾华肉用美利奴羊二倍体染色体数目为2n=54,26对常染色体中有3对为中着丝粒染色体,23对端着丝粒染色体;在性染色体中,X染色体为最大的端着丝粒染色体,Y染色体为最小的中着丝粒染色体。综上,乾华肉用美利奴羊染色体数目为2n=54(占95.8%),G-带与其他绵羊品种的G-带基本一致。

乾华肉用美利奴羊精液稀释保存的研究与应用效果评价

为了研究常温和低温环境下不同稀释液对乾华肉用美利奴羊精液保存效果的影响,试验采集6只乾华肉用美利奴羊种公羊精液,取合格精液混匀后均分为7份,其中4份利用A液(萄萄糖-柠檬酸钠)、B液(萄萄糖-乳糖-柠檬酸钠)、C液(萄萄糖-蔗糖-柠檬酸钠)、D液(萄萄糖-果糖-柠檬酸钠-EDTA)稀释后进行常温(15~18℃)保存,3份利用E液(萄萄糖-柠檬酸钠-卵黄)、F液(果糖-柠檬酸钠-卵黄)和G液(生理盐水-卵黄)稀释后进行低温(2~4℃)保存,均保存24 h后测定精子体外存活时间和存活指数,选择最适常温和低温保存稀释液;然后将720只同期发情的乾华肉用美利奴羊种母羊随机分为6组,每组120只,利用上述筛选的常温和低温最适稀释液保存的0 h(精液稀释后立即输精)及6,12 h乾华肉用美利奴羊精液进行人工授精,测定母羊繁殖性能指标(第一情期妊娠母羊数、总妊娠母羊数、产羔数、第一情期受胎率、总受胎率、产羔率),筛选最适乾华肉用美利奴羊精液的保存方式。结果表明:常温条件下,C液保存的精子体外存活时间和存活指数均显著优于A液、B液、D液(P<0.05);低温条件下,F液保存的精子体外存活时间和存活指数显著高于E液、G液(P<0.05);利用C液进行常温保存的精液的平均第一情期受胎率、总受胎率和产羔数均显著高于利用F液进行低温保存的精液(P<0.05)。说明最适乾华肉用美利奴羊精液保存条件为利用C液在常温下保存。

绵羊生殖器官GDF9基因的表达研究

生长分化因子9(GDF9)是绵羊多胎性状的重要候选基因,探讨GDF9在不同发育时期的母羊生殖器官的表达规律,对揭示其调控母羊生殖器官的发育具有重要的意义。以2月龄(性成熟前)、6月龄(性成熟)和12月龄(性成熟后)这3个不同生理阶段的雌性绵羊卵巢、输卵管、子宫内膜为对象,采用RT-PCR技术分析GDF9蛋白在相应生殖器官中的表达,并分析其相对表达量;采用免疫组织化学法对GDF9基因在相应生殖器官中的表达进行定位分析。荧光定量PCR结果显示,GDF9在2月龄与6月龄间、2月龄与12月龄间的卵巢上均表现出极显著的差异性(P<0.01),而6月龄与12月龄则无显著性差异(P>0.05);GDF9在2月龄与6月龄间的子宫内膜上表达无显著差异(P>0.05),而在2月龄与12月龄间、6月龄与12月龄间的子宫内膜上的表达均差异显著(P <0.05);GDF9在3个年龄间的输卵管上的表达均无显著性差异(P>0.05)。免疫组织化学试验结果显示,GDF9蛋白在2月龄、6月龄和12月龄绵羊子宫内膜和输卵管的上皮细胞及卵巢的颗粒细胞上均能表达,说明GDF9在不同生理阶段的绵羊生殖器官上表达且存在特异性细胞定位。

乾华肉用美利奴羊发情周期中卵巢组织结构的研究

本研究利用组织学方法对处于发情周期不同时期的乾华肉用美利奴羊卵巢的形态结构进行了显微观察。结果,乾华肉用美利奴羊的卵巢由被膜（位于表面的生殖上皮和深层的结缔组织白膜）、实质部（外周的皮质层和中央的髓质层）构成,原始卵泡和初级卵泡位于皮质层的浅层,次级卵泡和三级卵泡分布于皮质层的深部,而且这两类细胞易发生塌陷式、皱缩式和囊肿式等不同形式的闭锁。发情间期的乾华肉用美利奴羊卵巢上原始卵泡数量显著地高于其他三个时期（P〈0.05）,而其余三个时期相互间差异不显著（P〉0.05）;卵巢上初级卵泡数量在发情周期的各个时期间均差异显著（P〈0.05）、发情期的初级卵泡数量极显著地高于发情后期（P〈0.01）;发情间期和发情前期之间、发情期和发情后期之间的次级卵泡数量无显著差异（P〉0.05）,但发情间期和发情前期的次级卵泡数量均显著地高于发情期和发情后期;三级卵泡数在发情间期、发情前期、发情期三个时期之间差异不显著（P〉0.05）,但这三个时间段均显著地高于发情后期（P〈0.05）;成熟卵泡仅见于发情期。乾华肉用美利奴羊在发情周期的各个时间段,各级卵泡均发生卵泡闭锁,次级卵泡的闭锁数量在发情的各个时间段均具有明显的差异（P〈0.05）,发情期的闭锁数量最高,发情间期最低;发情期的三级卵泡的闭锁数量显著地高于其他三个时期（P〈0.05）,发情前期最低,而发情间期和发情后期相互间的三级卵泡闭锁数量差异不明显（P〉0.05）,但均显著高于发情前期（P〈0.05）。由上述研究结果可知,乾华肉用美利奴羊的母羊卵巢上的各级卵泡呈＂波状＂交替发育,且闭锁与发育并存,这些研究结果为开展超数排卵等繁殖生物学技术的应用奠定了理论基础。

Wnt10b在乾华肉用美利奴羊毛囊周期中的表达规律

为研究Wnt10b在乾华肉用美利奴羊毛囊发育周期中的表达规律，试验采用荧光定量RCR、免疫印迹与免疫组化方法对兴盛期（9月）、退行期（1月）、休止期（3月）皮肤中Wnt10b的表达规律进行了测定。结果从基因与蛋白水平上证明，Wnt10b的表达具有规律性，兴盛期表达量最高，主要表达于毛母质细胞，内外根鞘也有少量表达；退行期表达量逐渐减少，进入休止期后表达量降至最低，几乎不表达。进一步说明Wnt10b对乾华肉用美利奴羊毛囊的周期性生长具有重要的调节作用。