芩百清肺浓缩丸对感染后咳嗽大鼠NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的影响

目的:探讨芩百清肺浓缩丸(芩百)对感染后咳嗽(PIC)大鼠NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1/白细胞介素1β(NLRP3/Caspase-1/IL-1β)信号通路的调节作用。方法:40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组(阿斯美)及芩百清肺浓缩丸(芩百)组,每组10只。采用烟熏联合LPS滴鼻法及辣椒素雾化吸入法构建PIC模型。于造模后第18天开始灌胃给药,芩百组给予芩百清肺浓缩丸水溶液1.65 g/kg,阳性对照组给予阿斯美25.11 mg/kg,每日1次,连续给药10 d。末次干预后,ELISA检测BALF中IL-1β含量,、Western blot检测肺组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达。结果:与正常组相比,模型组BALF中IL-1β含量以及肺组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达均显著升高(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组和芩百组上述指标均显著降低(P<0.05);芩百组BALF中IL-1β水平和肺组织NLRP3蛋白表达均显著低于阳性对照组(P<0.05)。结论:芩百清肺浓缩丸能够显著减轻PIC大鼠的气道炎症和气道高反应性,其作用机制可能与抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路有关。

基于超高效液相色谱/四极杆-静电场轨道阱质谱联合网络药理学筛选“芩百清肺浓缩丸”治疗肺炎的活性成分

为筛选中药地龙在芩百清肺浓缩丸治疗肺炎时贡献的活性成分,本研究在开展细胞实验证实芩百清肺浓缩丸抗炎作用的基础上,采用超高效液相色谱/四极杆-静电场轨道阱质谱(UHPLC/Q-Exactive Orbitrap MS)法检测有、无地龙的芩百清肺浓缩丸提取液,借助Compound Discoverer软件筛选差异离子,根据二级质谱数据及标准品鉴定差异成分,进一步开展差异成分治疗肺炎的网络药理学研究,预测活性成分与靶点,并通过分子对接与实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)技术验证活性成分与靶点。结果表明,芩百清肺浓缩丸可通过降低细胞炎症因子IL6、IL-1b,趋化因子CXCL2和CXCR2的表达发挥抗炎活性,通过液相色谱-质谱筛选得到了15个差异成分,网络药理预测得到7个潜在活性成分及22个核心靶点,其中α-亚麻酸和腺苷经分子对接及RTqPCR实验验证为地龙在芩百清肺浓缩丸治疗肺炎时贡献的活性成分。该方法为筛选中药复方中组方药材贡献活性成分提供了参考,为中药复方活性成分研究提供了思路。

芩百清肺浓缩丸对感染后咳嗽大鼠SP、CGRP、NEP的影响

目的:观察芩百清肺浓缩丸(芩百)对感染后咳嗽(PIC)大鼠肺泡灌洗液和血清SP、CGRP及NEP含量及肺组织SP及NEP表达的影响,探讨芩百清肺浓缩丸对感染后咳嗽气道神经源性炎症的干预作用。方法:40只大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组(孟鲁司特)和中药芩百组。采用烟熏加内毒素(LPS)滴鼻以及辣椒素雾化吸入法建立PIC大鼠模型。各组大鼠给予相应处理10 d,观察大鼠3 min咳嗽次数变化,ELISA法检测BALF、血清中SP、CGRP和NEP含量,免疫组化检测肺组织SP、NEP蛋白表达并进行半定量评分,HE染色光镜观察支气管和肺组织病理改变。结果:1)咳嗽次数比较:阳性对照组和中药组咳嗽次数低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05),两药物组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2)SP、CGRP及NEP含量比较:中药组BALF、血清中SP和CGRP含量均低于模型组和阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中药组BALF中NEP含量接近正常组水平,高于模型组和阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.05);各组血清中NEP含量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3)肺组织SP与NEP免疫组化检测结果显示:与模型组比较,中药组SP表达明显减弱、NEP表达增强,差异有统计学意义(P<0.05);阳性对照组与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:芩百清肺浓缩丸能够降低感染后咳嗽大鼠血清及BALF中SP、CGRP的含量及肺组织SP的表达,提升BALF中NEP的含量及表达至接近正常水平。芩百清肺浓缩丸能够且不仅仅是通过NEP-SP途径来降低感染后咳嗽的气道神经源性炎症。

芩百清肺浓缩丸对感染后咳嗽豚鼠IL-6、TNF-α、SP的影响

目的:观察芩百清肺浓缩丸对感染后咳嗽(PIC)豚鼠炎症因子的影响。方法:40只豚鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组(阿斯美)和芩百组,每组10只。模拟革兰阴性菌感染法造模PIC豚鼠,各组灌胃给药10 d,辣椒素雾化吸入诱咳;监测咳嗽次数和咳嗽潜伏期,ELISA法测定各组豚鼠血清及支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、P物质(SP)含量。结果:与模型组比较,阳性组和芩百组的咳嗽潜伏期延长、咳嗽次数减少;与阳性组比较,芩百组咳嗽潜伏期延长;差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,阳性组和芩百组血清和BALF中的IL-6、TNF-α和SP含量均减少;差异有统计学意义(P<0.05);与阳性组比较,芩百组血清中IL-6、TNF-α含量以及BALF中TNF-α、SP含量均减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:芩百清肺浓缩丸能够从炎症始动初期即发挥作用,多靶点减轻PIC状态下的炎症反应、减轻和延缓咳嗽。

芩百清肺浓缩丸对肺炎支原体感染的影响

目的探讨芩百清肺浓缩丸对肺炎支原体感染的影响。方法采用MTT、流式细胞术考察体外芩百含药血清对肺炎支原体感染的A549细胞增殖能力和凋亡的影响。运用RT-PCR、免疫组织化学检测体内小鼠肺组织MEK、c-jun mRNA及蛋白表达,HE染色观察肺组织病理改变。结果与模型组比较,芩百含药血清(10%、20%)组能促进肺炎支原体感染的A549细胞增殖并抑制细胞凋亡(P<0.05)。体内实验表明,芩百清肺浓缩丸能减轻MP感染小鼠肺组织损伤;促进肺组织MEK、c-jun mRNA及蛋白表达(P<0.05)。结论芩百通过激活MEK和c-jun因子表达促进肺炎支原体感染肺上皮细胞的修复。

UPLC-Q-TOF-MS法分析芩百清肺浓缩丸中的化学成分

目的建立超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)法分析芩百清肺浓缩丸(黄芩、百部、紫菀等)中的化学成分。方法分析采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm);流动相为0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B),梯度洗脱;体积流量0.3 m L/min;柱温35℃。结果共鉴定出78个化合物,14个来自黄芩,29个来自百部,10个来自麦冬,13个来自紫菀,3个来自桔梗,9个来自地龙。结论该方法准确快速,可用于芩百清肺浓缩丸的鉴定分析。

基于NEP-SP调控通道分析芩百清肺浓缩丸治疗感染后咳嗽大鼠的量效关系

目的分析不同剂量芩百清肺浓缩丸治疗感染后咳嗽模型大鼠的量效关系。方法 80只鼠随机分为空白组(予0.9%氯化钠溶液)、模型组(予0.9%氯化钠溶液)、对照组(复方甲氧那明水溶液,相当于成人每次2粒,每日3次)、芩百1组(相当于成人每次3 g,每日2次)、芩百2组(相当于成人每次3 g,每日3次)、芩百3组(相当于成人每次6 g,每日2次)、芩百4组(相当于成人每次6 g,每日3次)、芩百5组(相当于成人每次9 g,每日3次),每组10只。采用烟熏联合LPS鼻腔滴注法及辣椒素雾化吸入诱导模拟革兰阴性菌感染的方法进行造模,造模成功后连续灌胃10 d。观察造模后2 min内、给药后第5天和第10天咳嗽次数。采用ELISA法检测BALF和血清中速激肽P物质(SP)和中性内肽酶(NEP)水平。结果芩百1组血清SP低于对照组,差异有统计学意义(P <0.05)。芩百2组咳嗽次数与对照组比较,差异无统计学意义(P> 0.05),BALF中SP低于对照组,NEP高于对照组,差异有统计学意义(P <0.05)。芩百4组的咳嗽次数和SP均低于对照组,差异有统计学意义(P <0.05)。结论芩百2组剂量能肺内抗炎和有效止咳,芩百4组剂量能明显缩短咳嗽缓解时间,止咳效果优于复方甲氧那明水溶液。芩百清肺浓缩丸治疗感染后咳嗽作用效果存在正相关的量效关系。

芩百清肺浓缩丸对小鼠肺部慢性炎症合并肺炎支原体肺炎的疗效观察

目的探讨芩百清肺浓缩丸对小鼠肺部慢性炎症合并肺炎支原体肺炎后纤维蛋白分泌的抑制作用。方法利用Real-time PCR、免疫组织化学、HE和Masson方法检测肺部慢性炎症合并肺炎支原体肺炎小鼠Wnt5a、α-SMA的m RNA、蛋白水平的影响。结果芩百清肺浓缩丸治疗组Masson染色显示纤维素沉积减少,Real-time PCR和免疫组织化学检测显示细胞因子Wnt5a及α-SMA表达降低。结论芩百清肺浓缩丸可抑制肺部慢性炎症合并肺炎支原体肺炎小鼠纤维素沉积,药物作用的靶点为Wnt5a及α-SMA。

芩百清肺浓缩丸含药血清促进肺炎支原体感染细胞增殖作用的实验研究

目的:观察芩百清肺浓缩丸含药血清对肺炎支原体感染A549细胞增殖作用的影响。方法:利用流式细胞技术鉴定分裂期A549细胞,免疫组化法测定芩百清肺浓缩丸含药血清对肺炎支原体感染A549细胞及分裂期A549细胞MEK、ERK表达的影响。结果:芩百清肺浓缩丸含药血清组A549细胞和分裂期A549细胞的MEK和ERK蛋白表达明显增强,与模型组组比较差异显著。结论:芩百清肺浓缩丸含药血清通过MEK、ERK通路促进细胞增殖,特别是分裂期细胞。

芩百清肺浓缩丸对感染肺炎支原体小鼠TRPA1、P物质的影响

目的:研究芩百清肺浓缩丸治疗小鼠感染肺炎支原体后咳嗽的作用机制。方法:实验分为正常对照组、模型组、阳对组(阿奇霉素0.03 g/kg)和芩百组(2.34 g/kg),通过BALB/c小鼠鼻腔滴入20μL10^(6)CCU肺炎支原体造模,各组小鼠灌胃给予相应药物7 d。引咳实验观察各组小鼠咳嗽情况,HE染色观察各组小鼠肺组织变化,免疫组化观察各组小鼠肺组织TRPA1(瞬间受体电位离子通道)蛋白表达,RT-PCR检测小鼠肺组织TRPA1及P物质mRNA表达。结果:与模型组相比,芩百组和阳对组均能降低小鼠咳嗽次数,HE染色显示芩百组小鼠肺组织支气管黏膜水肿减轻,免疫组化结果显示芩百组小鼠肺组织TRPA1蛋白表达减弱(P<0.05),RT-PCR结果显示芩百组小鼠肺组织TRPA1和P物质mRNA表达减少(P<0.05)。结论:芩百清肺浓缩丸通过降低咳嗽蛋白TRPA1和气道神经源性炎症介质P物质的表达治疗肺炎支原体感染后咳嗽。

HPLC测定芩百清肺浓缩丸中次黄嘌呤

目的:建立芩百清肺浓缩丸中次黄嘌呤的高效液相含量测定法。方法:采用HPLC-DAD法,色谱柱Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相甲醇-水(2∶98),检测波长254 nm,流速1.0 mL·min-1,柱温30℃。结果:次黄嘌呤在1.94～31.04μg呈良好线性关系,r=0.999 9,平均回收率为99.14%,RSD 1.28%。结论:方法操作简便、灵敏度高、准确性和重复性好,可作为芩百清肺浓缩丸的质量控制方法。

芩百清肺浓缩丸对肺炎支原体感染BALB/c小鼠NLRP3炎性体的影响

目的探讨芩百清肺浓缩丸对肺炎支原体(MP)感染BALB/c小鼠NLRP3炎性体蛋白表达及IL-1β分泌的影响。方法实验分为健康对照组、MP模型组、罗红霉素治疗组(50mg/kg体重)及芩百清肺浓缩丸治疗组(3.3g/kg体重),每组32只。滴鼻法建立MP感染模型,连续给予相应的药物14d,健康对照组及模型组给予等容量蒸馏水。分别于给药后7、14、28d,抽取肺泡灌洗液,ELISA检测IL-1β含量;留取肺组织,Western blot检测NLRP3炎性体相关蛋白表达。结果 MP模型组小鼠造模后7、14d肺组织NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相对表达量分别为0.93±0.07、0.72±0.02、0.65±0.03;0.41±0.04、0.47±0.02、0.43±0.02,与健康对照组0.30±0.02、0.29±0.02、0.31±0.03;0.27±0.03、0.23±0.02、0.34±0.02比较差异有统计学意义(P<0.01);芩百清肺浓缩丸治疗组给药后7d、14dNLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相对表达量分别为0.56±0.07、0.52±0.04、0.44±0.02;0.32±0.02、0.33±0.02、0.35±0.02,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。MP模型组小鼠给药后7、14d肺泡灌洗液IL-1β分别为(69.98±8.97)pg/ml、(49.55±7.60)pg/ml,与健康对照组(37.39±4.28)pg/ml和(36.61±4.31)pg/ml比较,差异有统计学意义(P<0.01);芩百清肺浓缩丸治疗组给药后7、14dIL-1β分别为(59.70±8.16)pg/ml和(41.39±3.67)pg/ml与模型组比较差异有统计学意义(P均<0.05)。结论芩百清肺浓缩丸治疗可下调MP感染小鼠肺组织NLRP3炎性体蛋白的表达及IL-1β分泌。

芩百清肺浓缩丸对感染后咳嗽豚鼠SP、M2受体及TRPV1的影响

目的:分析芩百清肺浓缩丸治疗感染后咳嗽(PIC)的效应机制。方法:烟熏、辣椒素雾化吸入联合脂多糖腹腔注射进行PIC造模。以阿斯美为对照,0.14 g/m芩百水溶液以1 mL/100 g体质量灌胃给药10 d。辣椒素雾化吸入诱咳。ELISA法测定血清P物质(SP),支气管肺泡灌洗液(BALF)中SP、瞬时感受器电位阳离子通道香草酸受体1(TRPV1)含量。RT-PCR法测定BALF和肺组织中TRPV1、M2受体mRNA水平。Western Blot法检测肺组织TRPV1、M2受体蛋白表达水平。结果:与模型组比较,芩百组与阿斯美组血清和BALF中SP含量显著减少(P<0.05),BALF中TRPV1含量显著减少(P<0.05),BALF中TRPV1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05),肺组织中TRPV1蛋白表达显著降低(P<0.05),BALF和肺组织M2受体mRNA表达水平、肺组织M2受体蛋白表达显著增加(P<0.05)。与阿斯美组比较,芩百组BALF中SP含量显著减少(P<0.05),肺组织TRPV1 mRNA表达水平显著增加(P<0.05),肺组织M2受体mRNA及蛋白表达显著增加(P<0.05),BALF中M2受体mRNA表达显著增加(P<0.05)。结论:TRPV1激活在PIC发病中作用更大。芩百清肺浓缩丸能够降低PIC的SP水平、降低TRPV1基因表达、修复和上调M2受体。

芩百清肺浓缩丸对支原体肺炎小鼠肺组织上皮间质转化的影响

目的探讨芩百清肺浓缩丸对肺炎支原体肺炎小鼠肺上皮间质转化的影响。方法将Balb/c小鼠随机分为对照组、模型组、阿奇霉素(0.03 g/kg)组及芩百清肺浓缩丸高、中、低剂量(4.6、2.3、1.15 g/kg)组,每组10只。除对照组外,其余各组小鼠进行支原体滴鼻,每只滴入20μL 1×10^(7)CCU肺炎支原体菌液,建立肺炎支原体感染模型。支原体肺炎模型建立成功后各组分别ig给予小鼠相应药物,连续ig 14 d。实验结束后取出小鼠肺组织,显微镜下观察各组小鼠肺组织苏木精–伊红(HE)染色、Masson染色以及免疫组化的肺组织变化。RT-PCR法检测各组小鼠肺组织E-钙黏蛋白(E-cadherin)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和波形蛋白(Vimentin)mRNA表达量。结果与模型组相比,芩百清肺浓缩丸组小鼠肺组织结构明显得到改善,结构清晰,组织形态规整。与模型组比较,芩百清肺浓缩丸组小鼠肺组织E-cadherin mRNA及蛋白表达增高;TGF-β1、Vimentin mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论芩百清肺浓缩丸能够降低肺组织中TGF-β1、Vimentin的表达,增加E-cadherin的表达,从而抑制上皮间质转化。

芩百清肺浓缩丸药物配伍对黄芩苷吸收的药动学比较

将芩百清肺浓缩丸按中药方剂理论拆方并分组,通过给大鼠灌胃各受试药物组,比较各组黄芩苷药动学参数的变化,阐明芩百组方的合理性及臣药在组方中的重要作用。对大鼠进行分组,分别灌胃君药组(黄芩粗提物,主要为黄芩苷)、与君药组黄芩苷含量相等的臣药组及芩百组(全方组),在28 h内于不同时间点采集大鼠血浆,应用HPLC测定大鼠血浆中的黄芩苷的药时曲线,用3P97实用药动学计算程序对所得数据进行处理。通过对数据分析得出,芩百全方组大鼠血浆中黄芩苷的Cmax是君药组的4倍,AUC是君药组的6倍;芩百全方组大鼠血浆中黄芩苷含量最高,臣药组大鼠血浆中黄芩苷含量不及全方组,但明显高于君药组。通过以上药动学结果得知,芩百能明显增加黄芩苷的Cmax和AUC,芩百中的其他中药成分促进了黄芩苷在体内的吸收,表明芩百复方配伍的合理;臣药对黄芩苷的体内吸收有促进作用。

芩百清肺浓缩丸治疗肺炎支原体感染大鼠模型细胞因子表达水平变化

目的分析芩百清肺浓缩丸治疗肺炎支原体(MP)感染大鼠细胞因子表达水平变化,进一步探究芩百清肺浓缩丸对其免疫机制及炎症反应的调控。方法 SPF级成年雄性Wistar大鼠(90~110 g)60只随机分为4组:正常对照组、肺炎支原体肺炎模型(MP组)、芩百清肺浓缩丸组及阿奇霉素组。通过经鼻反复感染MP构建感染模型,对照组鼻内滴入等体积支原体改良培养基。芩百清肺浓缩丸组及阿奇霉素组从MP感染日起连续4天分别给与芩百清肺浓缩丸3.2 g/kg及阿奇霉素25 mg/kg,每日1次,模型组给予等量生理盐水灌胃。给药后第5天抽取血样、分离血清检测各组大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及γ干扰素(IFN-γ)水平,留取大鼠肺组织检测Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核转录因子-κB(NF-κB)蛋白表达水平。结果与对照组比较,MP组、芩百清肺浓缩丸组及阿奇霉素组大鼠血清中TNF-α含量显著升高(均P<0.05),与MP组比较,芩百清肺浓缩丸组及阿奇霉素组TNF-α水平显著降低(均P<0.05),但芩百清肺浓缩丸组与阿奇霉素组TNF-α水平无显著性差异;与对照组比较,MP组、芩百清肺浓缩丸组及阿奇霉素组IFN-γ含量均呈不同程度的降低(均P<0.05),与MP组比较,芩百清肺浓缩丸组及阿奇霉素组的IFN-γ水平均升高(均P<0.05),但芩百清肺浓缩丸组与阿奇霉素组IFN-γ水平无显著性差异;肺组织实时荧光PCR(qPCR)结果显示,与对照组比较,MP组、芩百清肺浓缩丸组及阿奇霉素组的TLR4、MyD88、 NF-κB mRNA表达水平均呈不同程度的升高(均P<0.05),与MP组比较,芩百清肺浓缩丸组和阿奇霉素组上述指标水平显著降低(均P<0.05),但芩百清肺浓缩丸组和阿奇霉素组上述指标水平无显著性差异。免疫印迹(WB)结果示TLR4、MyD88、 NF-κB的蛋白表达变化趋势与mRNA一致。结论芩百清肺浓缩丸可降低MP感染大鼠TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α的表达水平,增加IFN-γ的水平,从而减轻MP肺炎的炎症反应。

基于UPLC-Q-TOF-MS技术分析桔梗对芩百清肺浓缩丸化学成分的影响

目的:比较芩百清肺浓缩丸全方和缺桔梗方两组药物成分的变化。方法:运用UPLC-Q-TOF-MS技术,在正、负离子扫描模式下进行测定。运用MarkerView1.2.1软件进行主成分分析,找出组间样品中的差异离子,结合PeakView2.0/Masterview1.0软件,依据保留时间、一级二级质谱图、元素组成等信息进行目标筛查,确定两组间的差异化合物,进行相对定量分析。结果:在药物成分相对含量的比较中,共找到14个具有显著性差异的化合物,芩百清肺浓缩丸全方与缺桔梗方相比,相对含量较高的化合物有9个,其中6个来源于百部。结论:桔梗对芩百清肺浓缩丸中百部的化学成分影响较大。

芩百清肺浓缩丸对肺炎支原体CARDs TX的抑制作用及机制研究

目的探讨芩百清肺浓缩丸对肺炎支原体CARDs TX毒素蛋白表达的抑制作用。方法将Balb/c小鼠随机分为对照组、模型组、阿奇霉素组及芩百清肺浓缩丸4.6、2.3、1.15 g/kg组,每组9只。除对照组外,其余各组小鼠进行支原体滴鼻,每只滴入20μL 1×10^(6)CCU肺炎支原体菌液,建立肺炎支原体感染模型。支原体肺炎模型建立成功后各组分别ig小鼠相应药物,连续ig 7 d,末次给药结束后进行引咳实验,并处死小鼠,取血液与肺组织。显微镜下观察各组小鼠肺组织苏木精–伊红(HE)染色、Masson染色、免疫组化后的肺组织变化;RT-PCR法检测各组小鼠肺组织MPN372、BDKRB2表达量。结果与模型组相比,芩百清肺浓缩丸可显著降低肺炎支原体小鼠咳嗽次数;芩百清肺浓缩丸组小鼠肺组织结构明显得到改善,结构清晰,组织形态规整;芩百清肺浓缩丸组小鼠肺组织纤维化得到缓解;芩百清肺浓缩丸组小鼠肺组织MPN372、BDKRB2 m RNA表达显著降低(P<0.05)。结论芩百清肺浓缩丸通过降低肺组织中CARDs TX、BDKRB2的表达,减缓咳嗽症状,治疗肺炎支原体肺炎。