青娥丸质量控制的实验研究

采用薄层色谱法对青娥丸进行定性研究，并采用薄层扫描法测定其补骨脂素和异补骨脂系的含量。

补肾法对绝经后骨质疏松症肠道菌群的影响

目的探讨补肾法对绝经后骨质疏松症的可能作用靶点。方法将50只雌性大鼠随机分为空白组、模型组、青娥丸组、补肾化痰组和利维爱组,各10只。采用双侧卵巢切除术制备绝经后骨质疏松症模型。术后第5周开始灌胃,持续12周后取各组大鼠股骨标本,采用micro-CT检测大鼠骨密度及骨微结构。每组取5只大鼠结肠粪便样本,在样本质量评价后每组纳入3个样本进行数据质控,对物种组成、相对丰度信息、主成分和Network网络相关性等进行分析。结果补肾法代表方青娥丸和补肾化痰组均可增加去势骨质疏松大鼠模型骨密度,抑制骨丢失。15个样本中共含有细菌2023种、206种古菌、227种真菌、2508种病毒、以及1035种质粒基因组序列,并按照相对丰度比例显示了排在前20的物种。热图聚类显示各组组内菌属的分布模式规律存在一定相似性;Anosim分析R值为0.201,P值为0.0855;主成分分析提示所有样本的物种相似度较高,组间物种存在不同。说明了PMOP模型大鼠肠道菌群显示了一定的物种多样性,在已有物种属水平基础上,进一步进行Network网络分析发现相关性>0.5(P<0.05)的物种有37种,与丰度排于前20的物种比对后,发现补肾法药物组干预后PMOP可靠菌属为:乳酸杆菌属(Lactobacilles),约氏乳酸杆菌、罗伊氏乳酸杆菌、瑞士乳酸杆菌和卷曲乳酸杆菌尤甚。结论肠道菌群可能是补肾法治疗PMOP的关键靶点之一,其中乳酸杆菌属可能是重要的研究切入点。

LC-MS/MS法与HPLC法测定青娥丸中药效成分比较

目的:通过液质联用(LC-MS/MS)与高效液相色谱(HPLC)测定青娥丸中药效成分—松脂醇二葡萄糖苷、补骨脂素和异补骨脂素的含量比对,为其质量控制提供方法参考。方法:采用Kromasil C18色谱柱,以甲醇-0.1%甲酸为流动相进行梯度洗脱,使用多反应监测(MRM)模式,监测离子对为m/z 700.5→m/z 235.4(松脂醇二葡萄糖苷)、m/z 187.1→m/z 131.1(补骨脂素和异补骨脂素)进行LC-MS/MS法同时测定,与药典HPLC法分别测定的结果进行对比分析,比较二者的差异性。结果:3种成分LC-MS/MS法测定的方法回收率分别为99.08%、98.95%和98.56%,RSD分别为1.33%、1.43%和1.27%。结论:LC-MS/MS法同时测定青娥丸中的药效成分,与药典HPLC法相比具有简便、灵敏、准确等特点,适用于青娥丸的含量测定。

青娥丸对绝经后骨质疏松症患者骨密度、血清MMP-2水平及骨代谢指标的影响

目的观察青娥丸对绝经后骨质疏松症患者骨密度 (BMD)、血清基质金属蛋白酶-2(MMP-2)水平及骨代谢指标的影响。方法骨质疏松妇女96例随机分为青娥丸组48例,对照组48例,另32例BMD正常绝经妇女作为正常组。骨质疏松妇女均给予钙剂治疗,青娥丸组加用青娥丸治疗。各组均于用药0、12、24周,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清MMP-2、骨碱性磷酸酶(sBAP)、骨钙素(sOC)、Ⅰ型胶原交联C端肽(sCTx)和尿Ⅰ型胶原交联N端肽(uNTx)水平,双能X线吸收法(DEXA)测定腰椎正位、股骨颈、Ward’s三角和大粗隆的BMD。结果 治疗后青娥丸组BMD有不同程度的提高,而对照组和正常组BMD均下降;青娥丸组的sBAP、sOC均有明显升高,而MMP-2、sCTx、uNTx/Cr明显下降,对照组和正常组上述指标变化不明显。结论 青娥丸治疗绝经后骨质疏松症有效。

养颜青蛾丸对D-半乳糖诱导的小鼠衰老皮肤氧化应激及MMP-1、MMP-3表达的影响

目的观察养颜青蛾丸对D-半乳糖诱导的小鼠衰老皮肤氧化应激及MMP-1、MMP-3表达的影响。方法小鼠颈背部皮下注射D-半乳糖制备小鼠皮肤衰老模型。造模过程中,实验组同时每天给予养颜青娥丸低、中、高剂量组等体积药物灌胃。连续给药42 d后,测定小鼠血清SOD、MDA和小鼠皮肤组织上清液中SOD、MDA含量、皮肤含水量、皮肤胶原蛋白含量,Western blot检测皮肤组织中MMP-1、MMP-3蛋白表达。结果养颜青娥丸中、高剂量组小鼠皮肤含水量、皮肤胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ含量、血清和皮肤组织SOD含量均显著高于模型组(P<0.05)。养颜青娥丸中、高剂量组小鼠血清和皮肤组织MDA含量、MMP-1、MMP-3蛋白表达水平均显著低于模型组(P<0.05)。养颜青娥丸中、高剂量组小鼠皮肤含水量,皮肤胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ含量,血清和皮肤组织SOD含量,血清和皮肤组织MDA含量,MMP-1、MMP-3蛋白表达水平,两组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论养颜青娥丸通过调节氧化应激损伤,下调皮肤基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3的表达,继而提高皮肤含水量,增加皮肤胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ含量,从而延缓D-半乳糖诱导的小鼠皮肤衰老。

HPLC法同时测定青娥丸中7种成分的含量

目的:建立同时测定青娥丸中补骨脂素、异补骨脂素、佛手柑内酯、欧前胡素、三甲基补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮含量的方法。方法:采用高效液相色谱法。色谱柱为Kinetex-C_(18),流动相为甲醇-0.1%乙酸溶液(梯度洗脱),流速为1.0mL/min,检测波长为248 nm,柱温为30℃,进样量为20μL。结果:补骨脂素、异补骨脂素、佛手柑内酯、欧前胡素、三甲基补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮检测质量浓度线性范围分别为1.012~101.2μg/mL(r=0.999 9)、1.007~100.7μg/mL(r=0.999 7)、1.010~101.0μg/mL(r=0.999 9)、1.021~102.1μg/mL(r=0.999 9)、1.002~100.2μg/mL(r=0.999 6)、1.008~100.8μg/mL(r=0.999 9)、1.025~102.5μg/mL(r=0.999 8);定量限分别为0.15、0.15、0.30、0.30、0.15、0.30、0.30μg/mL,检测限分别为0.05、0.05、0.10、0.10、0.05、0.10、0.10μg/mL;精密度、稳定性、重复性试验的RSD<2.0%;加样回收率分别为95.3%~99.6%(RSD=1.9%,n=6)、96.1%~99.3%(RSD=1.2%,n=6)、95.2%~98.4%(RSD=1.4%,n=6)、95.4%~99.2%(RSD=1.5%,n=6)、96.1%~99.3%(RSD=1.5%,n=6)、95.6%~98.9%(RSD=1.4%,n=6)、95.2%~99.6%(RSD=1.6%,n=6)。结论:该方法简便、结果准确,适用于青娥丸中7种成分含量的同时测定。

青蛾丸在更年期综合征患者中的暴露反应模型

目的:建立青娥丸在更年期综合征患者体内的暴露-反应PK-PD模型,探讨植物雌激素对于女性更年期综合征的疗效以及个体因素对给药的影响。方法:基于青娥丸在更年期综合征患者临床试验数据,通过药物暴露-反应关系进行PKPD建模,并估算相关模型参数和变异。结果:最终选择药物中的有效成分补骨脂(其中含有14种香豆素类和黄酮类,总的有效成分含量占青娥丸总剂量的3.42%)作为体内的PK暴露量,PD指标采用24 h潮热次数相对基线的下降率。基础暴露反应模型为线性模型,模型参数Slope和Intercept的典型值(相对标准误%)分别为-56.2(10.2)和-14.6(22.2)。并添加体质量、疗程、剂量等因素作为模型的协变量。结论:对于青娥丸给药达12周以上,方能达到理想的疗效,而模拟不同体质量和给药疗程所建立的预测曲面模型提示,疗效和体质量呈负相关,与每日给药频次和疗程正相关。因此,针对不同患者根据体质量调节给药剂量,或疗效不佳者可适当加量、延长疗程。

基于加权基因共表达网络分析和分子对接探讨青娥丸治疗腰椎间盘突出症的作用机制

目的:基于加权基因共表达网络分析和分子对接探讨青娥丸治疗腰椎间盘突出症(lumbar disc herniation,LDH)的作用机制。方法:通过GEO数据库获取LDH相关数据集GSE124272,采用R软件构建加权基因共表达网络;通过模块基因与性状的关联分析筛选关键模块,以及模块基因与表型数据的关联分析筛选重要基因。利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)、中药分子机制生物信息学分析工具(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine,BATMAN-TCM)数据库检索青娥丸的活性成分,基于Uniprot数据库筛选活性成分的作用靶点,采用Cytoscape软件构建“药物-活性成分-靶点”网络。通过DisGeNET、GeneCards数据库获取LDH疾病靶点,将其与模块基因、青娥丸靶点取交集,作为青娥丸治疗LDH的关键靶点;采用R软件进行基因本体(Gene Ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析;采用AutoDockTools软件进行分子对接验证。结果:GSE124272数据集共涉及5495个基因,blue模块(R=0.63,P=0.008)可能是LDH的关键模块,筛选得到310个重要基因。青娥丸活性成分65个,排名前5的活性成分是补骨脂素、鞣花酸、原人参二醇、异补骨脂素、槲皮素。青娥丸作用靶点997个,LDH疾病靶点1127个,与关键模块基因取交集得到5个关键靶点,包括丝裂原活化蛋白激酶14(mitogen activated protein kinase 14,MAPK14)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等。KEGG富集分析筛选得到125条通路,包括MAPK信号通路、破骨细胞分化、细胞凋亡等。分子对接显示,青娥丸关键成分与关键基因有较强的结合活性。结论:青娥丸可能通过补骨脂素、鞣花酸、原人参二醇等活性成分作用于MAPK14、MMP-9、IL-1β等关键靶点,调控MAPK信号通路、破骨细胞分化等通路从而发挥治疗LDH的作用。

古方青娥丸治疗绝经后骨质疏松症的临床疗效观察

目的:观察古方青娥丸治疗绝经后骨质疏松症临床疗效,同时初步探讨剂量与有效性、安全性的关系。方法:60例绝经后骨质疏松症患者随机分成3组:A组(大剂量组),B组(正常剂量组),C组(安慰剂组),三组患者均治疗24周,服用钙尔奇D片。对三组患者治疗前后的临床症状、腰背四肢骨痛进行VAS评分,并对骨密度的改善情况进行评估,治疗期间行常规肝肾功能等检查。结果:A组与B组的主要临床症状、腰背四肢骨痛VAS评分治疗后均改善,差异有统计学意义(P值均小于0.01);A组改善优于B组,组间差异有统计学意义(P<0.05),C组治疗后差异无统计学意义(P>0.05);A组和B组治疗后骨密度增加差异有统计学意义(P值均小于0.01),A组增加优于B组,组间差异有统计学意义(P<0.05),C组治疗后差异无统计学意义(P>0.05)。结论:古方青娥丸能改善临床症状,升高骨密度值,用药安全,其疗效与剂量相关。