清肝九味散对肝纤维化大鼠Raf/MEK/ERK信号通路的影响

目的观察清肝九味散对肝纤维化大鼠的干预作用及其潜机制。方法采用随机数字表法将50只SD大鼠分为正常组、模型组、阳性对照组、蒙药低剂量组及蒙药高剂量组,每组10只。除正常组外,其余各组大鼠均通过腹腔注射四氯化碳(CCl_(4))建立肝纤维化模型。造模成功后,正常组大鼠给予蒸馏水灌胃,阳性对照组灌服水飞蓟素(SIL)10 mg/kg;蒙药低、高剂量组每日分别灌服清肝九味散水煎液0.525、4.725 g/kg。各组均每天灌胃1次,连续8周。采用全自动生化仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性水平;HE染色法观察肝组织病理变化;免疫组化法检测肝组织平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测基质金属蛋白酶2(MMP2)、Ⅰ型胶原α(COL1α)、基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)mRNA水平;蛋白免疫印迹(Western Blot)检测肝组织MMP2、TIMP1蛋白表达及Raf蛋白激酶1(Raf-1)、丝裂原活化细胞外信号调节激酶(MEK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化水平的变化。结果与正常组比较,模型组大鼠明显消瘦、暴躁,肝脏经HE染色后可见典型纤维化病理表现;阳性对照组和蒙药低、高剂量组大鼠一般状态有明显改善,肝脏病理损伤减轻,血清ALT、AST水平较模型组显著下降(P<0.01);RT-PCR结果显示:与正常组比较,模型组MMP2、COL1α、TIMP1 mRNA表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,阳性对照组、蒙药低、高剂量组MMP2 mRNA表达明显升高,TIMP1、COL1αmRNA表达明显降低(P<0.01)。免疫组化结果显示:与正常组比较,模型组α-SMA蛋白阳性面积显著升高(P<0.01);与模型组比较,蒙药低、高剂量组α-SMA蛋白表达均显著降低(P<0.01)。Western Blot结果显示:与正常组比较,模型组MMP2、TIMP1、p-Raf、p-MEK、p-ERK蛋白表达均显著升高(P<0.05):与模型组比较,阳性对照组及蒙药高剂量组MMP2蛋白表达明显升高,阳性对照组及蒙药各剂量组TIMP1、p-Raf、p-MEK、p-ERK蛋白表达明显下降(P<0.05,P<0.01),且蒙药高剂量组较蒙药低剂量组下降更明显(P<0.01)。结论蒙药清肝九味散对CCl_(4)诱导的肝纤维化大鼠一般状态有改善作用,能减轻大鼠肝脏的纤维增生程度,并通过调节MMPs/TIMPs体系促进细胞外基质(ECM)降解,其抗肝纤维化机制可能与抑制Raf/MEK/ERK信号通路有关。