Ercao Qinggan decoction regulates apoptosis of hepatocytes in mice with acute liver failure via the TLR4-mediated PI3K/Akt/GSK3βsignal pathway

Background:To clarify the inhibitory effect of Ercao Qinggan decoction(EQD)on acute liver failure(ALF)and its related mechanisms.Methods:HL-7702 hepatocytes were pretreated with TLR4 inhibitor CLI-095,glycogen synthase kinase 3β(GSK3β)inhibitor LiCl and different doses of EQD for 2 hours,and lipopolysaccharide(LPS)(10μg/mL)for 24 hours.Cell apoptosis,TNF-αand IL-6 and GSK3βwere detected by flow cytometry,immunofluorescence,quantitative polymerase chain reaction.After mice were gavaged with different concentrations of EQD for 12 days,ALF mouse models were established intraperitoneal injection of D-Gal/LPS.After 24 hours,the mice were euthanized and the liver tissue was stained with hematoxylin and eosin.Liver cell apoptosis,the serum levels of aspartate aminotransferase,alanine aminotransferase,TNF-αand IL-βwere detected by terminal transferase-mediated dUTP nick end-labelling,enzyme linked immunosorbent assay,quantitative polymerase chain reaction,and Western blotting,respectively.These methods were also used to test the mRNA expression of Bax,Bcl-2 and the protein expression of GSK3β,p-Akt/Akt in livers.Results:CLI-095,LiCl,and EQD significantly inhibited apoptosis induced by LPS,the mRNA expression of IL-6,TNF-αand the nuclear translocation of GSK3βin HL-7702 hepatocytes.EQD dose-dependently inhibited hepatocyte apoptosis,the serum concentration of aspartate aminotransferase and ALT,the expression of TNF-αand IL-β,the ratio of p-GSK3β/GSK3β,p-Akt/Akt in alanine aminotransferase mice.Conclusion:EQD can inhibit hepatocyte apoptosis in ALF mice through regulating TLR4/PI3K/Akt/GSK3βsignaling pathway.

HPLC法同时测定蒙药清肝玛努-4醇提物中6种成分的含量及指纹图谱的建立

目的建立同时测定蒙药清肝玛努-4醇提物中马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、牡荆素、甘草苷、甘草酸铵等成分的HPLC含量测定方法及指纹图谱研究。方法采用Agilent Eclipse XDB-C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈,梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,检测波长为230 nm(芍药苷、牡荆素、甘草苷)、237 nm(马钱苷酸)、250 nm(甘草酸铵)、270 nm(龙胆苦苷),柱温为30℃,进样量为10μL。结果蒙药清肝玛努-4醇提物中马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、牡荆素、甘草苷和甘草酸铵的质量浓度分别在0.0203~0.1210、0.0533~0.3177、0.0213~0.1270、0.0115~0.0690、0.0141~0.0838和0.0351~0.2091 mg/mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系(r≥0.9998),平均回收率分别为94.75%、99.49%、92.32%、95.82%、101.29%和98.04%,RSD分别为1.11%、0.76%、0.99%、2.75%、1.09%和2.43%(n=6)。建立了蒙药清肝玛努-4醇提物的HPLC指纹图谱,以S1号样品色谱图为参照图谱,通过多点校正和全谱峰匹配,生成对照指纹图谱,共确定10个共有峰,经与对照品比对指认了其中8个成分。结论所建立的测定方法及指纹图谱准确、可靠、重复性好、专属性强,为蒙药清肝玛努-4的质量控制及后续开发提供了依据。

清肝活血方调控Caspase-4/Caspase-3/GSDME介导的细胞焦亡改善酒精性肝损伤

[目的]研究清肝活血方(QGHXR)通过调控半胱天冬酶(Caspase)-4/Caspase-3/GSDME细胞焦亡通路防治酒精性肝病(ALD)的作用机制。[方法]将18只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和QGHXR组复制ALD小鼠模型。检测血清肝功能、血脂水平;苏木精-伊红(HE)染色及油红O染色观察肝脏病理改变及肝脏脂质沉积状况;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot)法及免疫荧光染色检测Caspase-4/Caspase-3/GSDME通路相关基因及蛋白表达情况。[结果]与空白对照组比较,模型组小鼠肝组织三酰甘油(TG)水平明显升高(P<0.01),血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平升高(P<0.05),血清白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平升高(P<0.05);肝脏组织出现病理改变及脂质沉积现象;肝组织IL-1B、IL-6、TNF-α、NLRP3 mRNA表达水平升高。与模型组比较,QGHXR组小鼠肝组织TG水平明显降低(P<0.01),血清ALT、AST、总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)水平降低(P<0.05),血清TG、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)以及血清高密度脂蛋白(HDL)水平升高(P<0.01);血清中血脂、肝脏病理改变及脂质沉积现象缓解;GsdmeN、Caspase-4、Caspase-3和C-Caspase-3基因及蛋白水平降低(P<0.05)。[结论]QGHXR可通过调节Caspase-4/Caspase-3/GSDME介导的细胞焦亡通路改善ALD小鼠肝损伤和脂质沉积。

清肝活血方及其拆方对库普弗细胞表达CD14、Toll样受体4及核因子-κB的影响

目的:探讨清肝活血方及其拆方对库普弗细胞(Kupffercell,KC)表达CD14、Toll样受体4(Tolllikereceptor4,TLR4)及核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)的影响。方法:原代分离大鼠KC,以一定剂量脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用一定时间,加入一定浓度的清肝活血方及其拆方清肝方和活血方药物血清,Western印迹法、实时聚合酶链式反应法和ELISA分别检测不同培养条件下KC膜受体CD14、TLR4、NF-κB和肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)的表达。结果:清肝方可以下调KC膜受体CD14的表达,但对NF-κB和TNF-α的表达影响不显著;活血方可以下调KC膜受体TLR4表达,抑制NF-κB和TNF-α的表达;清肝活血方可以下调KC膜受体CD14、TLR4,抑制NF-κB和TNF-α的表达。结论:清肝活血方通过下调CD14、TLR4及NF-κB的表达,抑制TNF-α的产生,保护肝细胞。

二草清肝汤预防小鼠内毒素性肝损伤观察及对肝脏TLR4表达的影响

目的:观察二草清肝汤对小鼠内毒素血症急性肝损伤的影响及Toll样受体4(toll-Likereceptor4 TLR4)表达的影响。方法:取BALB/c小鼠120只,随机分为正常对照组、内毒素肝损伤模型组及二草清肝汤大、小剂量组,各30只。二草清肝汤大、小剂量组分别予二草清肝汤6mg/kg、3mg/kg预防性灌胃,正常对照组与模型组给予等量生理盐水灌胃,1天1次。12天后除正常对照组外,另三组给予D-氨基半乳糖(D-Gal)和LPS腹腔注射,观察注射后1、2、4、6、12、24h时各组小鼠光镜下肝组织的病理变化,采用全自动生化分析仪检测血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,酶联免疫吸附法检测血清IL-12、TNF-α浓度,免疫组织化学法检测TLR4表达水平,RT-PCR检测肝组织TLR4 mRNA表达水平。结果:二草清肝汤大、小两个剂量组各个时间点血ALT值、血清IL-12、TNF-a水平均低于同时间点的模型组(P<0.05或P<0.01),TLR4 mRNA水平也明显低于同时间点的模型组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。但二草清肝汤大、小剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:预防性给予二草清肝汤,可抑制内毒素血症肝损伤小鼠肝脏炎症反应,其机制可能与下调LPS识别受体TLR4表达,并进而抑制下游炎症因子分泌有关。

滋肾清肝方及其有效成分对二肽基肽酶-4抑制作用的实验研究

目的:研究滋肾清肝方及其有效成分(2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷,1-脱氧野尻霉素和决明子苷、红镰霉素龙胆二糖苷、橙黄决明素、甲基钝叶决明素、白藜芦醇)对二肽基肽酶4(DPP-4)活性的影响,研究其发挥降糖作用的可能机制。方法:建立DPP-4抑制剂的体外筛选模型,对酶量、底物浓度、最适p H和反应时间进行优化,选择磷酸西格列汀片作为阳性对照药,通过建立的筛选模型对以上成分进行筛选,计算抑制率及IC50。结果:红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷、橙黄决明素、甲基钝叶决明素对DPP-4的抑制率<10%,白藜芦醇、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、1-脱氧野尻霉素、滋肾清肝方提取物、磷酸西格列汀对DPP-4的IC50值分别为(48.805±12.874)、(2.845±0.428)、(0.305±0.002)、(1.628±0.324)、(0.003±0.0005)mmol/L。结论:滋肾清肝方及其有效成分具有不同程度的DPP-4抑制作用,抑制DPP-4可能为其调节血糖的作用机制。

二草清肝汤对内毒素性肝损害模型大鼠肝脏Kupffer细胞TLR-4信号转导通路的影响

目的：探讨二草清肝汤对内毒素性肝损害模型大鼠肝脏Kupffer细胞的活化及功能依赖TLR4信号传导通路的影响。方法：120只雄性Wistar大鼠,随机分成空白组、模型组、二草清肝汤大剂量（20 g/kg）和小剂量组（10 g/kg）,每组30只,连续灌胃给药12 d。末次给药4 h后,除空白组外所有大鼠腹腔注射D-Gal N（800 mg/kg）/LPS（0.04 mg/kg）诱导内毒素性肝损害,造模后1、2、4、6、12、24 h每组取5只大鼠,Western印迹法检测Kupffer细胞Toll样受体-4（TLR-4）、TIR结构域的衔接蛋白（TRIF）、IL-1相关蛋白激酶（IRAK）、核因子-κB（NF-κB）蛋白表达变化。结果：造模后1、2 h,各组大鼠TLR-4、TRIF、IRAK、NF-κB蛋白表达无显著差异。造模后4、6、12、24 h,与空白组比较,模型组大鼠肝脏Kupffer细胞TLR-4、TRIF、IRAK、NF-κB蛋白表达明显增多（P〈0.05）;与模型组比较,二草清肝汤大、小剂量组大鼠肝脏Kupffer细胞TLR-4、TRIF、IRAK、NF-κB蛋白表达明显减少（P〈0.05）;大、小剂量组同时间比较无显著差异。结论：二草清肝汤可能通过抑制TLR-4信号转导通路的活性发挥其抗炎效应。

二草清肝汤对内毒素性肝损害防护作用的实验研究

目的:探讨中药二草清肝汤对内毒素/脂多糖(LPS)性肝损害的防护机制。方法:采用LPS腹腔注射(10mg/kg)制备小鼠内毒素血症肝损害模型,BALB/c小鼠200只随机分为正常对照组、LPS组、二草清肝汤小剂量组和二草清肝汤大剂量组;光镜观察肝组织病理学改变,全自动生化分析仪检测血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,酶联免疫吸附法检测血浆白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子(TNF)-α浓度,免疫组织化学法检测Toll样受体4(TLR4)表达水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织TLR4 mRNA表达水平。结果:二草清肝汤能明显提高小鼠存活率,肝组织病理损害程度减轻;二草清肝汤小剂量组及大剂量组小鼠的IL-12、TNF-α水平显著低于LPS组,差异有显著性意义(均P(0.05);二草清肝汤小剂量组和大剂量组小鼠肝组织TLR4 mRNA水平也明显低于LPS组,差异均有显著性意义(均P(0.05),但二草清肝汤大、小剂量组间差异无显著性意义(P>0.05)。结论:二草清肝汤能明显减轻LPS所致的肝损害,其机制可能与其下调肝脏各种细胞的TLR4表达,同时下调IL-12、TNF-α的水平有关。