副溶血弧菌QsvR ChIP-qPCR方法的建立

目的:建立副溶血弧菌QsvR的染色质免疫共沉淀实时定量PCR(ChIP-qPCR)实验方法。方法:通过热激转化和转化结合将标记2×Flag标签的qsvR片段转入qsvR突变株(ΔqsvR)中,阿拉伯糖诱导表达QsvR-2×Flag蛋白,通过甲醛与基因组DNA进行交联形成2×Flag-QsvR-DNA复合物,将基因组DNA超声裂解为100~1000 bp大小不等的片段,通过特异性抗原抗体反应将蛋白质-DNA复合物沉淀下来,高盐和加热解交联,回收DNA进行qPCR定量DNA,分析副溶血弧菌体内QsvR与靶基因的结合情况。结果:成功构建出实验菌株ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag,以不加阿拉伯糖诱导为对照,经阿拉伯糖诱导菌株的aphA、opaR、exsB和vtrA的免疫共沉淀量明显较高,表明在副溶血弧菌体内QsvR与aphA、opaR、exsB和vtrA具有结合作用。结论:成功建立了副溶血弧菌QsvR的ChIP-qPCR实验方法,可用于原核生物体内蛋白质-DNA相互作用的研究。

QsvR对副溶血弧菌Ⅵ型分泌系统1相关基因的转录调控

【目的】研究调控蛋白QsvR对副溶血弧菌Ⅵ型分泌系统1(typeⅥsecretion system 1,T6SS1)相关基因的转录调控关系。【方法】提取野生株(wild type,WT)和qsvR突变株(ΔqsvR)的总RNA,采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)研究QsvR对靶基因的调控关系;进而采用引物延伸法定位靶基因的转录起始位点和核心启动子区,并根据引物延伸产物丰度判断QsvR对靶基因的调控关系;将靶基因的调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒中的β-半乳糖苷酶基因上游(LacZ重组质粒),并将重组质粒转化入WT和ΔqsvR中,通过LacZ报告基因融合试验研究QsvR对靶基因的调控关系;将LacZ重组质粒分别转化入含有pBAD33或pBAD33-qsvR的大肠杆菌100λpir中,进一步采用LacZ报告基因融合试验研究在异体宿主中QsvR对靶基因的调控关系;PCR扩增靶基因调控区DNA序列,同时表达并纯化His-QsvR重组蛋白,采用凝胶阻滞试验(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)研究His-QsvR对靶基因调控区DNA序列是否具有直接的结合作用。【结果】qPCR结果显示,与WT相比,ΔqsvR中T6SS1相关基因VP1388(操纵子VP1388-1390首基因)和hcp1(操纵子VP1393-1406首基因)的转录水平显著性升高,表明QsvR抑制VP1388和hcp1的转录;引物延伸结果显示VP1388和hcp1各有一个转录起始位点,分别为C(-64)和T(-62),且它们的转录活性受QsvR的抑制;LacZ报告基因融合试验结果显示QsvR可以抑制副溶血弧菌和EC100λpir中VP1388和hcp1的启动子区转录活性;EMSA结果显示His-QsvR对VP1388和hcp1的启动子区DNA序列具有直接的结合活性。【结论】QsvR对T6SS1相关操纵子VP1388-1390和VP1393-1406的转录具有直接的抑制作用。

不同遗传背景下QsvR调控副溶血弧菌基因表达的转录组分析

【背景】OpaR是副溶血弧菌群体感应系统的核心调控因子;QsvR是AraC家族转录调控因子,与OpaR之间具有相互调控作用;此外,QsvR对基因表达的调控作用受OpaR的影响,但是影响程度并未完全阐明。【目的】探究在野生株(wild-type,WT)和opaR基因突变株(ΔopaR)的遗传背景下QsvR的转录调控元,分析Opa R对QsvR基因表达调控的影响。【方法】分别以WT和ΔopaR为参照,采用Illumina HiSeq测序平台进行比较转录组学研究,分析生物膜形成条件下qsv R基因突变株(Δqsv R)和Δqsv RΔopaR的基因表达情况。【结果】在WT遗传背景下,QsvR共调控1735个基因的转录(调控元1),其中被激活的基因有855个,被抑制的基因有880个;在ΔopaR遗传背景下,QsvR共调控1 187个基因的转录(调控元2),其中被激活的基因有533个,被抑制的基因有654个。调控元1和调控元2之间共有517个重叠基因,且QsvR对绝大多数重叠基因的调控关系相反。基因属性分类(gene ontology, GO)数据库富集分析结果显示,调控元1和调控元2中分别有467个和204个基因注释到分子功能、细胞组分和生物学过程3个一级分类和30个二级分类;京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)对代谢途径的分析结果显示,调控元1和调控元2中分别有372和678个基因归到30个代谢通路中(Q value<0.05),调控元1中的基因主要集中在代谢、基因信息处理和环境信息处理上,而调控元2中的基因主要集中在细胞代谢通路上。蛋白相邻类的聚簇(cluster of orthologous groups of proteins, COG)数据库分类结果显示,调控元1和调控元2中的基因主要涉及氨基酸转运与代谢、信号转导、能量产生与转换、一般功能预测基因和未知功能基因等。此外,调控元1和调控元2中还含有大量调控因子基因和推定的c-di-GMP代谢基因,以及若干极生鞭毛基因、荚膜多糖基因、胞外多糖合成基因、Ⅳ型菌毛合成基因、Ⅲ型分泌系统基因和Ⅵ型分泌系统基因等。【结论】QsvR是副溶血弧菌中的全局性调控因子,控制着大量基因的转录。QsvR对靶基因的调控关系及QsvR调控元组成均受OpaR的影响。