PRRSV、CSFV、PRV和PCV2四重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的四重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,针对PRRSV的ORF2基因、CSFV的5′UTR基因、PRV的gB基因、PCV2的ORF2基因设计了引物及Taq Man探针,并进行反应体系优化,敏感性、特异性验证,建立了同时检测上述4种病原的四重实时荧光定量PCR。结果显示,所建立的四重荧光PCR扩增效率(E)、相关系数(R^(2))及曲线斜率均在正常范围内,检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2 E值、R^(2)、斜率分别为92.9%、0.998、-3.504,90.7%、0.998、-3.566,94.3%、0.996、-3.466,94.2%、0.997及-3.470。PRRSV、CSFV、PRV、PCV2重组质粒最低检出限分别达到10^(2)、10^(2)、10^(2)、10^(3) copies/μL;四重qPCR反应体系中的多条引物间不发生交叉反应,经评价该方法特异性良好;批内和批间重复性试验结果显示,变异系数(CV)均在1%以下,具有良好的重复性。分别使用该方法和相应的国标荧光定量检测法对采集的298份临床样品进行检测对比,两种方法检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2阳性符合率分别为96.08%、96.38%、100%、94.95%,均在94%以上。结果表明,建立的检测方法方便、灵敏、高效、特异性强,适用于猪呼吸道疾病病原学、流行病学研究以及临床病例的诊断,并为猪呼吸道疾病的预防和控制提供技术支撑。

G-四链体与As-PCR联用可视化检测沙门氏菌

沙门氏菌是食源性病原菌,常在食品媒介中传播,因此快速检测是控制该病原菌的关键。本研究用沙门氏菌基因组DNA作模板,通过对不对称PCR(As-PCR)扩增条件的优化,证明当非限制性引物HF终浓度0.4μmol/L,与限制性引物GR终浓度比10∶1、退火温度58℃,扩增40个循环时可获得最大浓度的单链DNA(ssDNA)产物。带有G-四链体序列的ssDNA与40μmol/L氯化血红素作用60 min时,G-四链体显示出最高的过氧化物酶活性。在此基础上,将As-PCR和G-四链体联用,实现了可视化检测沙门氏菌invH基因,在2 pg/μL~258 ng/μL的质量浓度区间,质量浓度对数与吸光值A421nm呈线性关系(y=0.0691x+0.3085,R2=0.9729)。对污染的牛奶样品检测,检出灵敏度高,为35 CFU/mL,且操作便捷,为病原微生物检测提供了新技术支撑。

猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪流感病毒四重PCR检测方法的建立

为了快速、准确检测4种猪呼吸道病毒,根据NCBI GenBank数据库中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪流感病毒(SIV)的基因序列,设计4对特异性引物,建立一种能通过扩增片段大小来同时鉴别检测PRRSV(111 bp)、PRV(173 bp)、PCV2(273 bp)、SIV(445 bp)的四重PCR检测方法。特异性试验结果显示,扩增PRRSV、PRV、PCV2、SIV模板均能得到预期特异条带,而扩增灭菌水(阴性对照)、CSFV、JEV不产生任何条带。敏感性试验结果显示,该方法最低病毒核酸检出量分别为PRRSV(6.5×10^(4)copies/μL)、SIV(2.68×10^(5)copies/μL)、PCV2(7.16×10~5copies/μL)、PRV(2.37×10^(4)copies/μL)。用所建立的四重和各单一PCR方法检测45份临床样品,四重PCR的阳性检出率分别为PCV2 22.2%(10/45)、PRRSV 17.7%(8/45)、PRV 4.4%(2/45)、PRRSV+PCV2 13.3%(6/45),四重PCR方法与单一PCR方法的阳性符合率为100%。表明建立的病毒四重PCR检测方法特异性强、敏感性高,可用于上述4种呼吸道病毒的鉴别检测。

PCR可视化检测技术的开发及其在猪源性检测中的应用

该文以G-四链体和硫磺素T为报告体系,建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)可视化检测方法,仅需普通基因扩增仪和蓝光灯,即可在反应后通过肉眼观测荧光亮度直接判读结果,无需开盖,避免PCR产物污染问题的发生。并以猪源性DNA为检测目标设计特异性引物,建立猪源性可视化检测方法,通过对市售的牛、羊、兔、鸡、鸭肉对比,特异性良好,检测限达到0.01 ng/μL,可在混合肉DNA样品中检出1%的猪肉,并且能成功应用到实际食品样本的检测中。反应时间可控制在1 h以内,相较常用的实时荧光PCR,该方法既缩短时间,又不需要使用更昂贵的荧光PCR仪,且无需荧光基团修饰的探针,适合在简单的条件下进行快速定性检测。

几种外来动物病毒多重普通和实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用

为了能够同时开展对小反刍兽疫病毒(PPRV)、蓝舌病血清8型病毒(BTV8)、鹿流行性出血热血清1型病毒(EHDV1)和非洲马瘟病毒(AHSV)4种外来动物疫病病原体的核酸检测,本试验根据GenBank中相关病毒序列设计引物和探针,建立多重普通逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在采集的临床样本检测中进行初步应用验证。结果显示:建立的PPRV/BTV8/EHDV1三重实时荧光定量RT-PCR检测方法仅对PPRV、BTV8和EHDV1有特异荧光信号,检测敏感度可达10^(1.70)~10^(2.08) copies/μL DNA;建立的PPRV/BTV8/EHDV1/AHSV四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测PPRV、BTV8、EHDV1和AHSV,检测敏感度可达10^(3) copies/μL DNA;2种方法对羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、牛病毒性腹泻等临床相似的病毒均无扩增。在925份临床样本中检测出1例PPRV核酸阳性样本;经核苷酸序列测定及BLAST比对确定为谱系Ⅳ型PPRV毒株序列。本试验所建立的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法和四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测相应的3种或4种病毒病原,且具有临床样本检测的应用潜力。

四重荧光qRT-PCR检测猪腹泻相关病毒方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪delta冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus,PDCoV)和猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)的四重荧光qRT-PCR检测方法,本研究以PEDV的N基因、TGEV的S基因、PDCoV的M基因和PTV基因组5'非编码基因为检测对象,建立同时检测4种病毒的荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法可以特异扩增4种病毒的基因,不能扩增猪呼吸道冠状病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的基因;PEDV、TGEV、PDCoV和PTV的最低核酸检出量分别为141、68、8和11拷贝数;对100份送检样品进行检测,其中PEDV、TGEV、PDCoV和PTV感染检出率分别为10%、6%、2%和55%。结果表明本研究建立的检测方法具有良好的特异性和敏感性,而且操作快速简便,可用于猪腹泻疫病的临床诊断和流行病学调查。

转基因玉米品系及转化体成分四重实时荧光PCR快速鉴定

Bt11转基因玉米品系是耐除草剂抗虫玉米,MIR162和Mon89034是鳞翅目昆虫抗性的单抗虫玉米,均是国内外出入境监管主要关注的转基因玉米品系。本研究通过靶标基因筛选、转基因阳性样品采集、核酸样本制备、多重引物和荧光探针组合筛选、反应体系优化以及方法学验证等过程开发建立了四重荧光定量PCR检测技术。结果表明该技术的使用可实现一个反应管中同时检测MIR162、Bt11、Mon89034三个玉米品系的特异性基因序列和一个编码玉米淀粉合成酶异构体zSTSII-2(zSSIIb)玉米内源基因。通过阳性对照,阴性对照和空白对照特异性S曲线与对应的阈值大小分析可判定样品中是否含有这三个转基因玉米品系及其转化体成分。经方法学特异性检测,结果与转基因检测金标准的单实时荧光PCR结果一致;经平行样和灵敏度测试,最低检测限为18个拷贝;经标准曲线扩增分析,四个基因的扩增效率均在90%~110%范围内,扩增效果良好。该方法从DNA提取到报告结果不足3 h,可缩短检测时限,节约试剂耗材成本,操作简单易行,满足高通量特征,可为市场流通产品品系和转基因成分的实时监管和快速鉴定提供技术支撑。

基于G-四联体比色生物传感器检测肉制品中羊源性成分

近年来,肉制品掺假现象已成为社会关注的热点,鉴定畜产品中动物源性成分是打击掺假的一种重要技术手段。基于此,利用不对称PCR技术(asymmetric PCR,As-PCR),并结合G-四联体的功能特点,建立了一种G-四联体比色生物传感器以鉴定肉制品中羊源性成分。以羊的基因组DNA为模板,并在限制性正向引物的5′端加上一段G-四联体的反向互补序列,通过As-PCR扩增出大量含有G-四联体序列的单链DNA(single strand,ssDNA),生成的ssDNA在K+的作用下可与氯高铁血红素(hemin)结合形成具有DNA核酶(DNAzyme)活性的G-四联体-hemin复合物。该复合物可催化H2O2与2,2′-联氮-双(3-乙基-苯并噻唑琳-6-磺酸)二胺盐[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt,ABTS 2-]的反应,从而生成绿色的反应产物,结果可用肉眼观察,无需电泳、测序等常规检测步骤。通过对As-PCR反应条件和体系的优化,该生物传感器可实现对肉制品中羊源性成分准确、快速的鉴定,可稳定检测出的混合肉样中羊源性成分的最低质量分数为5%。研究所建立的G-四联体比色生物传感器具有简便、灵敏、可视化、低成本等优点,可用于肉制品中动物源性成分的检测,为肉制品的安全检测提供了强有力的技术支撑。

2021—2022年我国鸡马立克病的流行病学调查

为了解我国规模化养殖场中马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)的感染和免疫状态,采用四重TaqMan探针荧光定量PCR对采自我国11个省(自治区、直辖市)的19个养殖企业的94个鸡群的羽毛囊和环境样本进行MDV疫苗毒和野毒检测。结果显示,大部分养殖场存在野毒感染,其中山东地区样本平均阳性率较高为13.6%。不同省市白羽肉鸡、黄羽肉鸡和蛋鸡样本的野毒平均阳性率分别为8.3%、3.9%和7.2%。在不同日龄蛋鸡样本中,1~7、8~14和50~80日龄野毒阳性率较高,分别为12.6%、13.8%和14.3%。此外,单独免疫CVI988疫苗或以火鸡疱疹病毒(HVT)为载体的基因工程重组疫苗(rHVT)以及同时免疫这两种疫苗,均能降低MDV野毒的阳性率,且同时免疫两种疫苗鸡群的野毒阳性率最低。对不同免疫方式下疫苗在羽毛囊中复制情况的检测结果显示,在3~4周龄时,单独免疫CVI988疫苗的平均阳性率为91.4%,单独免疫rHVT疫苗的平均阳性率为58.2%,同时免疫两种疫苗时,CVI988疫苗和rHVT疫苗的平均阳性率分别为51.8%和36.9%,提示鸡场应切实做好马立克病的防控工作。本研究丰富了对MDV感染现状的新认识,为我国未来马立克病的防控提供了指导。