R-脊椎蛋白1表达与Wnt/β-catenin信号通路在乳腺癌中的相关性及临床意义

目的探讨R-脊椎蛋白1(RSPO1)、Wnt/β-catenin与乳腺癌生物学行为的相关性及其可能的机制。方法收集惠州市中心人民医院2009年1月至2015年12月乳腺癌病例标本,采用组织芯片免疫组织化学SP法,检测224例非特殊型乳腺浸润性癌(BIC-NST)、155例乳腺导管原位癌(BDCIS)及379例癌旁正常组织(NBTAC)中RSPO1、SFRP1、β-catenin的表达。结果RSPO1和β-catenin在BIC-NST及BDCIS组织中的表达明显高于NBTAC(P<0.01),而SFRP1在BIC-NST及BDCIS组织中的表达明显低于NBTAC(P<0.01);RSPO1和β-catenin在高级别BDCIS的表达率明显高于低级别组(P<0.01),在Ⅲ级BIC-NST分化组的表达率明显高于Ⅰ级分化组,而且组织分级越高RSPO1和β-catenin的表达越高,两者之间呈明显的正相关(r=0.114,P=0.023);但SFRP1在Ⅲ级BIC-NST分化组的表达率明显低于Ⅰ级分化组,且组织分级越高其表达越低,与RSPO1和β-catenin的表达均呈明显的负相关(r=-0.217,P=0.011)。RSPO1和β-catenin表达在患者临床分期Ⅲ+Ⅳ期中的表达明显高于Ⅰ+Ⅱ期的表达,且与淋巴结转移、脉管浸润相关(P<0.01);而SFRP1的表达有相反结果。结论RSPO1、β-catenin蛋白的高表达和SFRP1蛋白的低表达与乳腺癌的发生、发展密切相关,可为乳腺癌的诊断和靶向治疗提供新的靶点。

人成骨细胞分化及骨保护素分泌:R-脊椎蛋白1通过Wnt/β-catenin通路的作用

背景:研究表明Wnt/β-catenin信号通路活性受抑是类风湿关节炎骨侵蚀的始动因素,增强该通路有望治疗类风湿关节炎关节破坏。R-脊椎蛋白1(RSpo1)可能是Wnt激活剂,尚无人成骨细胞相关研究。目的:验证R-脊椎蛋白1抑制DKK1促进该细胞的分化成熟。方法:给予S40转染人成骨细胞株h FOB 1.19 Wnt-3a、R-脊椎蛋白1及Wnt信号通路抑制剂DKK1不同刺激,通过检测细胞增殖、碱性磷酸酶活性及骨保护素水平,观察R-脊椎蛋白1在成骨细胞中的作用。结果与结论:R-脊椎蛋白1对hF OB 1.19细胞增殖无影响,Wnt-3a上调碱性磷酸酶活性,与R-脊椎蛋白1共刺激可增强该作用;R-脊椎蛋白1可减少DKK1对h FOB1.19细胞碱性磷酸酶活力的抑制作用。R-脊椎蛋白1可提高骨保护素质量浓度,但R-脊椎蛋白1对骨保护素的增强作用大于DKK1对其的抑制作用。提示R-脊椎蛋白1通过抑制DKK1,参与Wnt/β-catenin信号通路,促进成骨细胞分化成熟,分泌骨保护素。

低氧相关的R-脊椎蛋白3对人乳腺导管癌细胞增殖能力的影响及其机制

目的体外观察低氧微环境对乳腺癌细胞增殖能力的影响,并探讨其分子机制。方法细胞增殖检测试剂盒(CCK-8)用于人乳腺导管癌细胞株(BT-474,购于中国科学院上海细胞库)经低氧处理后的增殖能力;应用基因芯片对低/常氧处理后的细胞进行差异基因的表达检测,并在体外行实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)验证;运用癌症基因组图谱(TCGA)及人类蛋白质表达图谱(HPA)数据库分析筛选的差异基因在乳癌及正常乳腺组织中的表达特征,并分析其水平与患者临床病理学特征及预后的相关性;基因组百科全书(KEGG)通路分析、基因过表达实验、蛋白质印迹法(Western blot)等方法探讨其发挥功能的分子机制,组间比较采用t检验。结果BT-474细胞分别经常氧、低氧干预24、36、48 h后,常氧组中的吸光度值显著低于低氧组(0.32±0.03比0.40±0.02,t=6.351;0.45±0.01比0.52±0.02,t=4.196;0.57±0.04比0.68±0.03,t=3.257;P<0.05);基因芯片分析结果提示R-脊椎蛋白3(r-spondin3,RSPO3)是细胞经低氧处理后显著抑制表达的基因之一;进一步的RT-PCR结果示,低氧组中RSPO3的相对表达量显著低于常氧组(0.56±0.03比0.82±0.04,t=12.583,P<0.05);TCGA分析结果示RSPO3在乳腺癌组织中的表达量较乳腺正常组织显著降低(1.41±0.37比3.54±0.19,t=14.648,P<0.01),其在乳腺癌组织中表达水平与肿瘤的直径呈负相关(r=-0.693,P<0.01);生存分析结果表明,RSPO3低表达组中患者的总生存期(OS)显著低于高表达组[(46.52±0.28)个月比(53.79±0.47)个月,t=21.357,P<0.01];此外,KEGG分析结果表明,细胞经低氧处理后β-catenin通路被预测为显著激活;Western blot结果示低氧组细胞核内β-catenin的表达量较常氧组显著升高(0.89±0.06比0.42±0.02,t=6.241,P<0.05);与低氧组比较,低氧下过表达RSPO3后24、36、48 h后细胞的吸光度值显著降低(0.43±0.03比0.32±0.02,t=4.458;0.51±0.01比0.39±0.02,t=3.267;0.66±0.03比0.49±0.04,t=4.103;P<0.05),而在低氧处理同时上调RSPO3表达后核内β-catenin的水平却明显降低(0.93±0.05比0.38±0.07,t=8.164,P<0.05)。结论低氧环境下BT-474细胞可能通过抑制RSPO3的表达,继而活化β-catenin通路促进乳腺癌细胞的增殖能力。

R-脊椎蛋白1对肝星状细胞活化的作用及其机制

目的 探讨R-脊椎蛋白1（R-Spondin1）在小鼠肝纤维化模型及肝星状细胞（HSC）中的动态表达情况及其对HSC活化的影响. 方法 体内实验：健康雄性昆明种小鼠24只,随机分为2组.模型组（16只）：用20％四氯化碳（CCl4）橄榄油5ml/kg皮下注射,2次/周;对照组小鼠（8只）不作任何处理.10周后处死小鼠,留取肝组织,Western blot检测R-Spondin1、α-平滑肌肌动蛋白（c-SMA）、胶原蛋白Ⅰ（collagen Ⅰ）的蛋白水平,Real-time PCR检测R-Spondinl、α-SMA、collagenⅠ的mRNA水平.体外实验：分离小鼠HSC,检测R-Spondin1、α-SMA、核内β-catenin的蛋白表达情况,以及R-Spondin1的mRNA水平、T淋巴细胞转录因子（TCF）活性在HSC自发激活前后的变化,并比较小鼠HSC经R-Spondin1和抑癌蛋白刺激前后的活化差异.两组间均数比较采用t检验;多组资料采用单因素方差分析,进一步的两两比较采用Dunnett检验. 结果 与对照组相比,肝纤维化模型组R-Spondin1蛋白和mRNA表达水平明显增高,差异有统计学意义（蛋白相对表达量为3.16±0.18与0.99±0.16,t=13.31,P＜0.01;mRNA相对水平为4.36±0.26与0.98±0.12,t=21.46,P＜0.01）.在HSC的自发激活过程中,核内β-catenin的蛋白水平和TCF活性显著增强（核内β-catenin蛋白相对表达量为4.47±0.21与0.97±0.14,t=25.25,P＜0.01;TCF相对活性为5.33±0.34与1.03±0.09,t=20.93,P＜0.01）;R-Spondin1的蛋白和mRNA表达水平显著上调（蛋白相对表达量为4.54±0.18与1.04±0.12,t=31.17,P＜0.01;mRNA相对水平为5.13±0.15与1.01±0.16,t=38.06,P＜0.01）.α-SMA、核内β-catenin的蛋白表达及TCF活性在R-Spondin1刺激后显著上调;而在R-Spondin1和抑癌蛋白共同刺激后无显著变化. 结论 R-Spondin1可能通过增强β-catenin在细胞核内的积聚影响HSC的活化.

R-Spondin2、Syndecan-1在小鼠肝星状细胞活化中的作用研究

目的探讨R-脊椎蛋白2(R-Spondin2)、多配体蛋白聚糖1(Syndecan-1)在小鼠肝星状细胞(HSC)活化中的作用及可能的作用机制。方法将24只雄性昆明种小鼠随机分为6组,每组4只,将每组小鼠肝脏分离并培养HSC。H1组:HSC分离培养1d;H2组:HSC分离培养3d;H3组:HSC分离培养7d;R+S-组:HSC分离培养24h后,给予20 ng/ml R-Spondin 2刺激24h;R-S+组:HSC分离培养24h后,给予20 ng/ml Syndecan-1刺激24h;R-S-组:HSC分离培养48h,未予任何刺激。采用Western blot、RT-PCR法分别检测各组小鼠HSC R-Spondin 2、Syndecan-1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白与m RNA表达情况。结果与H1组比较,H2、H3组小鼠HSC R-Spondin 2、α-SMA蛋白与m RNA表达均上调(均P<0.05),Syndecan-1蛋白与m RNA表达均下调(均P<0.05);与H2组比较,H3组小鼠HSC R-Spondin 2、α-SMA蛋白与m RNA表达均上调(均P<0.05),Syndecan-1蛋白与m RNA表达均下调(均P<0.05);与R-S-组比较,R+S-组小鼠HSC Syndecan-1蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05),α-SMA蛋白表达水平上调(P<0.05);与R-S-组比较,R-S+组小鼠HSC R-Spondin 2、α-SMA蛋白表达水平均下调(均P<0.05)。结论随着HSC体外培养时间的延长,Syndecan-1表达下调,R-Spondin 2、α-SMA表达上调,HSC发生活化;其作用机制可能为HSC培养时间延长,Syndecan-1发生降解,R-Spondin 2表达上调诱导α-SMA蛋白表达增加,促使HSC活化。

RSPO3抑制体内结直肠癌移植瘤生长和增加NK细胞浸润的作用研究

背景与目的:结直肠癌的发生、发展涉及多个癌基因的激活和抑癌基因的失活,野生型R-脊椎蛋白3(R-spondin 3,RSPO3)在结直肠癌生长中的作用目前尚不清楚,本研究旨在探讨RSPO3对结直肠癌生长的影响并探索其潜在机制。方法:采用生物信息学分析RSPO3在结直肠癌及泛癌组织中的表达,分析结直肠癌中RSPO3表达与自然杀伤(natural killer,NK)细胞浸润、NK细胞激活分子表达的相关性。利用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)和慢病毒感染建立RSPO3敲减的SW480-RSPO3-KD细胞株、RSPO3过表达的HCT116-RSPO3-OE细胞株及相应的对照细胞株。采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测体外各稳定转染细胞株的细胞增殖。采用流式细胞术分析各稳定转染细胞株的细胞周期、裸小鼠脾脏和移植瘤组织中NK细胞的比例。通过裸小鼠皮下移植瘤模型观察RSPO3敲减或过表达的结肠癌细胞在裸小鼠体内的生长。利用双荧光素酶报告基因系统检测RSPO3敲减或过表达对结肠癌Wnt基因转录活性的影响。结果:生物信息学分析显示,RSPO3在多种实体瘤肿瘤组织包括结直肠癌组织中的表达显著低于相应的癌旁组织。RSPO3敲减或过表达不影响体外SW480和HCT116结肠癌细胞的增殖(P>0.05)和细胞周期(P>0.05)。但在裸小鼠体内,与对照细胞相比,RSPO3敲减显著促进SW480细胞移植瘤的生长(260.2±162.4 vs 1311.7±570.1,P<0.05),而RSPO3过表达则显著抑制HCT116细胞移植瘤的生长(1549.0±241.2 vs 512.1±250.0,P<0.05)。流式细胞术分析发现,在荷移植瘤裸小鼠体内,RSPO3敲减显著减少了脾脏和移植瘤组织中NK细胞的比例(脾脏:6.42±0.94 vs 5.25±0.59,P=0.04;移植瘤:8.27±0.29 vs 6.48±1.48,P=0.04);而RSPO3过表达显著增加了脾脏和移植瘤组织中NK细胞的比例(脾脏:5.29±0.16 vs 7.02±0.49,P=0.01;移植瘤:6.39±0.39 vs 8.14±0.34,P<0.05)。癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据相关性分析显示,RSPO3表达与NK细胞表面标志物CD56(r=0.58,P<0.05)和CD16(r=0.64,P<0.05)的表达显著正相关,并与NK细胞激活标志物CD69(r=0.51,P<0.05)和KLRB1(r=0.37,P<0.05)的表达显著正相关。双荧光素酶报告基因实验结果显示,RSPO3敲减后Wnt荧光素酶活性下调(1.0±0.0 vs 0.45±0.09,P<0.05),而RSPO3过表达后Wnt荧光素酶活性上调(1.0±0.0 vs 1.75±0.14,P<0.05)。结论:RSPO3能在体内显著抑制结直肠癌移植瘤的生长,并能增加移植瘤组织中NK细胞浸润,RSPO3是一个潜在的结直肠癌的抑制基因。

乳腺浸润性导管癌RSPO1、β-catenin表达及其特点

探究R-脊椎蛋白1(RSPO1)、β-连环蛋白(β-catenin)与乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系。2017年5月—2020年5月,256例乳腺浸润性导管癌患者,采用免疫组化染色法检测RSPO1、β-catenin在癌组织及癌旁正常组织中表达水平,分析RSPO1、β-catenin表达与乳腺浸润性导管癌患者临床病理特征及预后的关系。结果显示,乳腺浸润性导管癌患者癌组织中RSPO1、β-catenin阳性表达率显著高于癌旁正常组织(P<0.05);月经状态、年龄、肿瘤直径不同的乳腺浸润性导管癌患者癌组织中RSPO1、β-catenin表达水平差异无统计学意义(P>0.05);组织学分级、淋巴结转移、TNM分期不同的乳腺浸润性导管癌患者癌组织中RSPO1、β-catenin表达水平差异有统计学意义(P<0.05);RSPO1、β-catenin阳性表达的乳腺浸润性导管癌患者5年无进展生存率显著低于RSPO1、β-catenin阴性表达的乳腺浸润性导管癌患者(P<0.05)。结果表明,RSPO1、β-catenin在乳腺浸润性导管癌中呈高表达,其表达水平与乳腺浸润性导管癌患者组织学分级、淋巴结转移、TNM分期及5年无进展生存率显著相关。

四妙勇安汤对糖尿病溃疡大鼠Wnt/β-catenin信号通路表达的影响

目的观察糖尿病溃疡模型大鼠中Wnt/β-catenin信号通路表达的变化及四妙勇安汤对该通路的影响。方法雌性Wistar大鼠按随机数字表随机分为正常对照组(对照组,17只)和糖尿病组(DM组,34只)。对照组给予普通饲料继续饲养,糖尿病组采用高脂高糖饲料联合小剂量链脲佐菌素液腹腔注射法制备糖尿病模型。随后将造模成功大鼠分为糖尿病溃疡组(DU组)、糖尿病溃疡-四妙勇安汤组(DU-四妙组),每组各15只。于对照组选取15只,作为溃疡对照组(CU组)。DU-四妙组采用四妙勇安汤灌胃,CU组及DU组采用生理盐水灌胃。观察创面造模后第3、7、14日各组创面愈合情况的变化,并采用HE染色法检测创面组织形态结构的变化,采用ELISA法、RT-PCR法检测创面组织中β-连环素(β-catenin)、糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、R-脊椎蛋白3(R-spondin 3,Rspo-3)蛋白及mRNA的变化。结果创面造模后第3、7、14日,各组大鼠创面愈合率均为CU组>DU-四妙组>DU组,差异有统计学意义(P<0.05)。创面造模后第3、7、14日,与CU组比较,DU组创面组织中β-catenin及Rspo-3蛋白含量及mRNA表达降低,GSK-3β蛋白含量及mRNA表达升高(P<0.05);与DU组比较,DU-四妙组β-catenin蛋白含量及mRNA表达升高,GSK-3β蛋白含量及mRNA表达降低(P<0.05),DU组与DU-四妙组间Rspo-3蛋白含量及mRNA表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Wnt/β-catenin通路的下调有可能导致了糖尿病溃疡的难愈,而四妙勇安汤也可能通过对Wnt/β-catenin信号通路进行调节而促进了糖尿病溃疡的愈合。

LGR5与肿瘤发生发展关系的研究进展

LGR5是一种表达于多种正常细胞和肿瘤细胞膜的膜蛋白,其与配体R-spodin结合可增强Wnt-β-catenin信号通路,导致肿瘤的进展。LGR5在维持干细胞特性中起着关键作用,可以作为肿瘤干细胞标志物。LGR5靶向治疗能显著抑制肿瘤的生长和转移。本文将通过其与肿瘤关系的研究进行综述。