基于CRISPR/Cas13a技术检测肿瘤驱动基因TP53 R248W的研究

目的:建立一种基于CRISPR/Cas13a的TP53 R248W变异体的快速检测技术。方法:根据Over-lap PCR技术,以TP53野生型质粒为模板构建TP53 R248W变异体质粒;对TP53R248W变异体扩增产物大小,扩增反应条件及crRNA长度和浓度进行优化,初步建立基于CRISPR/Cas13a的R248W变异体快速检测方法;利用不同突变率TP53 R248W变异体及模拟血浆ctDNA,评价CRISPR/Cas13a方法的检测灵敏度。结果:建立的CRISPR/Cas13a方法成功检测出产物大小为368 bp的TP53R248W片段;在0.05~0.25μmol/L浓度范围内,crRNA浓度越高,检测结果相对荧光值越高;该方法检测TP53 R248W变异体的灵敏度为1×10~4拷贝/μL,最低可以检测出突变率为0.01%的变异体。结论:建立的CRISPR/Cas13a方法具有快速、简便、灵敏、特异等优点,为组织和血浆中的TP53 R248W变异体的检测提供了新的技术手段。