缺氧后活化Drp1通过偶联LRRK2影响多组织细胞线粒体功能的机制研究

目的探究缺氧后活化Drp1对线粒体能量代谢和有氧呼吸的调控机制。方法在心肌细胞(H9C2)、血管平滑肌细胞系(vascular smooth muscle cells,VSMC)、肠上皮细胞系(intestinal epithelial cells,IEC)中通过免疫共沉淀、免疫荧光方法观察多种细胞类型缺氧后Drp1活性变化及与线粒体损伤的关系;利用ZDOCK方法建立Drp1与同源激酶LRRK2蛋白互作模型,验证缺氧后Drp1-LRRK2偶联情况;以VSMC细胞为代表,通过Drp1点突变T595A破坏缺氧后Drp1-LRRK2的偶联,分别检测了培养基酸化程度、细胞外乳酸含量等反映无氧呼吸的指标和线粒体膜电位、ATP生成量等反映有氧呼吸的指标。结果缺氧后Drp1的Thr磷酸化水平增高、线粒体损伤明显。进一步研究发现缺氧后Drp1蛋白与LRRK2蛋白界面残基间存在大量氢键,导致缺氧后Drp1-LRRK2偶联从而影响线粒体功能。具体表现为糖酵解过程中乳酸生成的增多和线粒体有氧呼吸过程中膜电位的减低。结论缺氧后活化Drp1可通过偶联LRRK2破坏线粒体能量代谢和有氧呼吸,加重多器官组织线粒体损伤。

Klotho缺乏致小鼠自发性血压升高的初步机制

目的探讨小鼠体内Klotho(KL)缺乏对血压的影响及其初步机制。方法使用KL基因半敲除129Sv小鼠作为实验组(KL^+/-组),同种系同龄129Sv小鼠作为对照组(WT组),每组各20只。自10周龄起,应用无创VPR tail-cuff法监测小鼠血压,每周2次,至23周龄结束。取小鼠尿液,采用ELISA法检测小鼠尿微量白蛋白水平;心脏穿刺取血,ELISA法检测小鼠醛固酮水平,尿素、肌酐测定试剂盒检测血尿素、肌酐水平;取肾脏制备石蜡切片,HE染色观察肾脏组织病理结构;免疫组织化学法检测肾脏KL蛋白表达;Masson染色观察肾脏纤维化水平,并进行半定量分析;Western blot测定肾脏组织中KL、SGK1、NCC、ATP synthaseβ蛋白的表达。结果与WT组比较,KL^+/-组小鼠肾脏KL蛋白水平显著下降(P<0.01);自16周龄起出现持续、自发的血压升高;23周龄末KL^+/-组小鼠尿白蛋白与血肌酐比值、血肌酐和血尿素水平增高,肾脏病理重塑和纤维化明显(P<0.01);小鼠醛固酮水平升高且SGK1、NCC、ATP synthaseβ蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论体内KL的减少可能导致小鼠自发性血压升高,其机制可能与KL缺乏导致的肾脏损害和醛固酮水平升高所致的水钠潴留相关。