RNA干扰Rac1基因表达对结直肠癌LoVo细胞骨架和细胞周期的影响

目的:观察Rac1蛋白在结直肠癌细胞中的表达,并分析其与结直肠癌LoVo细胞骨架、细胞周期和细胞凋亡的相关性。方法:Western blotting测定5种结直肠癌细胞株(LoVo,SW480,SW620,SW1116,HT29)中Rac1蛋白的表达;Rac1-shR-NA质粒转染LoVo细胞后,激光共聚焦显微镜观察LoVo细胞骨架的变化,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化。结果:5种结直肠癌细胞株中均有Rac1蛋白的高表达。Rac1基因沉默后,LoVo细胞中交联状态的F-actin网明显减少且紊乱,G0/G1期细胞比例较对照组显著增加[(74.63±4.40)%vs(56.46±3.09)%,P<0.05],而S期细胞比例较对照组显著减少[(12.87±1.77)%vs(29.66±1.92)%,P<0.05];Rac1-shRNA转染组LoVo细胞凋亡率较对照组显著增加[(25.31±2.05)%vs(9.38±1.16)%,P<0.05]。结论:RNA沉默Rac1基因的表达影响了LoVo细胞骨架的形成和细胞周期,为以Rac1为靶点治疗结直肠癌提供了实验依据。

RNA干扰Rac1基因表达抑制胃癌细胞增殖及促进凋亡的机制研究

目的 RNA干扰抑制Rac1基因的表达对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法 Western blot检测胃癌组织及相应的癌旁组织中Rac1基因的蛋白表达;将NC-siRNA、Rac1-siRNA转染至人胃癌SGC-7901细胞,不经任何处理的细胞作为空白对照组,48 h后,Western blot检测各组细胞中Rac1的蛋白表达;CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测ki67、PCNA、Cleaved caspase3、Notch1、Hes1蛋白表达。结果 Rac1在胃癌组织中的蛋白表达显著高于癌旁组织(P<0.01);RNA干扰SGC-7901细胞中Rac1基因后能显著降低Rac1的蛋白表达;与对照组及NC-siRNA组比较,Rac1-siRNA组细胞存活率及ki67、PCNA、Notch1、Hes1蛋白表达显著降低,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论 Rac1基因在胃癌组织中高表达,RNA干扰抑制Rac1基因表达后能显著降低细胞的增殖及诱导细胞凋亡,其机制与抑制Notch1信号通路有关。

鸡RAC1基因真核表达载体的构建及其在颗粒细胞中的表达验证

为构建鸡RAC1基因真核表达载体并观察该载体是否在鸡卵泡颗粒细胞中表达,试验采用PAS方法合成RAC1基因,先将其克隆至pUC57-simple载体中,然后再亚克隆至表达载体pYr-adshuttle-4上,将重组载体瞬时转染至鸡卵泡颗粒细胞中,通过荧光定量PCR和Western Blot进行验证。结果表明,RAC1基因正确地插入到了载体pYr-adshuttle-4的多克隆位点,且重组载体转染成功。试验成功构建了鸡源pYr-adshuttle-4-RAC1真核表达载体,并成功将其转入到鸡卵泡颗粒细胞中。该载体的构建为进一步研究RAC1的生物学功能提供了重要工具。

马身猪和大白猪背最长肌Rac1基因发育性表达研究

[目的]探究Rac1基因mRNA和蛋白质在马身猪和大白猪背最长肌组织中的发育性表达规律,揭示Rac1基因与猪肌肉发育之间的关系。[方法]采用qRT-PCR和Western blot技术检测马身猪和大白猪从1日龄到180日龄(1、30、60、90、120、150和180日龄)阶段背最长肌中Rac1基因的表达规律。[结果]Rac1基因mRNA在大白猪1日龄、120日龄和180日龄时表达量较高,与其他日龄相比差异极显著(P<0.01),其他日龄表达量均维持在较低水平;马身猪60日龄时Rac1 mRNA表达量最高,极显著地高于其他日龄(P<0.01),90日龄次之,其他日龄表达水平较低,且日龄间表达量无显著差异。在蛋白质水平上,从1日龄到180日龄,大白猪Rac1表达量整体呈先降低后升高的趋势,在1日龄时表达量最高,120日龄表达量最低;马身猪整体呈先升高后降低的趋势,60日龄时表达量最高,极显著高于其他日龄(P<0.01),随后几个月龄的表达量处于较低水平,显著低于1日龄和30日龄(P<0.05)。品种间比较,马身猪Rac1蛋白表达量始终高于大白猪,且在1日龄和60日龄,差异极显著(P<0.01),在120日龄和150日龄,差异显著(P<0.05)。[结论]猪背最长肌中Rac1基因mRNA和蛋白质的表达量与猪的年龄及遗传背景有关。

灰葡萄孢菌Rac1基因的生物信息学分析

利用多种不同序列分析软件,基于生物基因组学数据库,对灰葡萄孢菌Rac1基因进行生物信息学分析,以预测BCRac1基因编码产物的理化性质、结构与功能,同时构建Rac1基因同源系统进化树。结果表明:BCRac1基因编码产物由150个氨基酸构成,为亲水性蛋白,没有信号肽,二级结构以α-螺旋与无规则卷曲为主,推测其主要在细胞核中发挥生物学作用。结构功能域分析表明,BCRac1基因编码产物可能主要具有生长因子的功能,对灰葡萄孢菌的激素调节有影响。构建的Rac1基因编码产物系统进化树显示,BCRac1基因与核盘菌、稻瘟病菌、炭疽菌等物种Rac1基因遗传距离较近,具有高度同源性。

苎麻小分子G蛋白Rac1基因的克隆及表达分析

植物Rac是植物中特有的小分子G蛋白,我们从苎麻转录组中获得一个小分子G蛋白基因cDNA的部分序列,设计引物后采用RT-PCR结合RACE技术克隆了该基因的cDNA。序列分析表明,所克隆的Rac1 cDNA全长为1 043 bp,包括594 bp开放阅读框、214 bp的3′端非编码区和235 bp的5′端非编码区,能编码一个197氨基酸的推导蛋白。该蛋白包含G蛋白典型的效应因子结合位点、GTP/GDP结合位点和碱性氨基酸区,C末端具有保守的异戊烯基化位点CSIL。采用半定量RT-PCR分析了该基因在5个苎麻品种及不同组织器官中的表达情况,结果表明Rac1基因在苎麻根、茎、叶中均有表达,其中在叶中的表达量最高。纤维木质素含量不同的品种中,Rac1基因的表达量存在明显差异。木质素含量高的品种具有较高的Rac1基因表达,表明该基因可能在苎麻木质素合成过程中发挥作用。

Rac1基因真核表达质粒的构建及其对结肠癌细胞生物学功能的影响

目的应用分子生物学技术构建Rac1基因真核表达质粒及小分子RNA(siRNA)干扰片段,通过调控其表达,研究Rac1蛋白对结肠癌细胞生物学功能的影响。方法从结肠癌细胞中扩增Rac1基因,构建pCDNA3.1(+)-Rac1和pEGFP-Rac1真核表达质粒实现过表达Rac1基因;通过小分子RNA干扰抑制Rac1基因表达。利用侵袭实验、划痕实验研究Rac1基因对结肠癌细胞侵袭和迁移能力的改变;通过Pull-Down实验,研究调控Rac1表达对癌细胞中GTPase活性的影响。结果成功构建Rac1基因真核表达质粒。通过调控Rac1蛋白的表达证实其与结肠癌细胞中Rac1GTPase的活化程度,以及肿瘤细胞的迁移和侵袭能力呈正性关联。结论通过抑制Rac1的表达,可以有效阻止Rac1 GTPase的激活,从而抑制肿瘤细胞的迁移及侵袭,为抑制结肠癌进展提供新的干预靶点,也为进一步免疫生物过继治疗提供了必要的实验基础。

Rac1基因对纤维肉瘤细胞侵袭胶原蛋白屏障的影响和机制研究

目的 体外研究外源Rac1基因表达对HT1080纤维肉瘤细胞侵袭胶原蛋白屏障的影响及其机制.方法 将转染显性负调控突变体Rac1V12N17(HN)、持续活化型Rac1V12(HV)或空载体(HW)纤维肉瘤HT1080细胞,在含胶原蛋白凝胶三维基质中培养,用得克萨斯红结合的鬼笔环肽染色显示细胞肌动蛋白骨架结构.用胶原蛋白凝胶薄膜覆盖滤膜的Transwell小室进行细胞侵袭胶原屏障实验,并观察2种蛋白酶抑制剂对上述细胞侵袭实验的影响.采用明胶酶谱法检测在三维基质中培养的上述转染细胞分泌型基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达和活化.结果 胶原蛋白凝胶中培养的HV和HN细胞在形态上表现出明显差异,前者有更多伪足样突起;HV细胞侵袭胶原屏障能力大于HW细胞,而后者又强于HN细胞,这种差别在应用广谱MMP抑制剂后消失,而抑肽酶则无影响;外源Rac1的表达促进胶原和纤维蛋白基质中培养的HT1080纤维肉瘤细胞分泌型MMP-2的表达和活化.结论 外源持续活化型Rac1基因在纤维肉瘤HT1080细胞内稳定表达,可诱导细胞内肌动蛋白聚集,增强细胞侵袭胶原屏障能力.Rac1表达促进MMP-2活化可能是其重要机制之一.

PREX1基因与肿瘤发病机制关系的研究进展

磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸依赖性Rac交换因子1(PREX1)是一种编码基因,其在多种肿瘤中异常表达。PREX1基因编码蛋白作为一种小GTP结合蛋白Rac1的鸟嘌呤核苷酸交换因子(RacGEF)能够通过激活Rac1,形成PREX1/Rac通路,与多种经典信号通路发生串扰,参与调节肿瘤过程的多种受体反应,影响肿瘤微环境的上皮-间充质转化过程,在肿瘤的增殖、转移和预后方面发挥作用。

Twist在宫颈癌细胞株Hela中的表达变化及其对细胞侵袭转移的影响

目的观察扭曲因子Twist在宫颈癌细胞株Hela中的表达变化,并探讨其对Hela细胞侵袭转移的影响以及作用机制。方法取宫颈癌细胞株Hela以及人宫颈永生化上皮细胞H8,采用Western blotting法检测细胞中Twist蛋白。常规培养宫颈癌细胞株Hela,分为对照组、过表达组、沉默组,后两组采用慢病毒转染技术分别过表达和沉默细胞中的Twist基因,采用boyden实验检测细胞侵袭能力;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;Western blotting法检测Rac1以及MMP-2蛋白。结果 Hela细胞中Twist蛋白表达高于H8细胞(P<0.05)。与对照组相比,过表达组细胞中Twist蛋白表达升高,细胞侵袭、迁移能力增强,Rac1、MMP-2蛋白表达增加(P均<0.05);与对照组相比,沉默组细胞中Twist蛋白表达降低,细胞侵袭、迁移能力减弱,Rac1、MMP-2蛋白表达降低(P均<0.05)。结论 Twist在宫颈癌细胞株Hela中高表达,促进/抑制其表达可以显著增强/降低Hela的侵袭转移,机制可能是通过作用于侵袭转移相关蛋白Rac1、MMP-2的表达进而调控细胞的侵袭转移。