miR-182通过RAC1通路促进骨肉瘤HOS细胞凋亡

目的:检测miR-182在骨肉瘤HOS细胞中的表达,通过构建过表达miR-182的转染载体检测miR-182对骨肉瘤HOS细胞凋亡的影响。方法:RT-qPCR检测骨肉瘤HOS细胞miR-182表达。构建过表达miR-182的转染载体,进行转染后细胞共培养,RT-qPCR检测转染后miR-182表达,显微镜下观察细胞形态。Western blot分析miR-182对RAC1通路蛋白的作用,CCK-8法分析过表达miR-182对骨肉瘤HOS细胞生长的抑制情况,流式细胞术评估miR-182对骨肉瘤HOS细胞细胞周期及凋亡的影响。结果:骨肉瘤HOS细胞中miR-182呈低表达。构建过表达miR-182的转染载体,骨肉瘤HOS细胞中RAC1通路蛋白及下游PAK1蛋白表达显著下调。过表达miR-182显著促进骨肉瘤细胞凋亡并阻滞其细胞周期进程。结论:miR-182可通过靶向调控RAC1通路促进骨肉瘤HOS细胞凋亡并阻止其细胞周期进程。

DADS通过Rac1/LIMK1/cofilin1通路增强沉默LIMK1抑制人胃癌BGC823细胞迁移侵袭

探讨二烯丙基二硫(DADS)通过Rac1/LIMK1/cofilin1通路对沉默LIMK1抑制BGC823细胞迁移侵袭的影响。划痕实验和侵袭实验观察迁移和侵袭能力;RT-PCR、Western blot、免疫组化检测LIMK1、Rac1、Rock1、Pak1与Cofilin1和p-Cofilin1表达。结果显示,DADS处理沉默组疤痕距离较对照组和沉默组增加(P<0.05)。DADS处理沉默组穿膜细胞低于对照组、空载体组与沉默组(P<0.05)。沉默组LIMK1表达低于对照组和空载体组,DADS后,各处理组低于处理前各组(P<0.05)。并且,沉默组、对照组和空载体组的Rac1、Rock1、Pak1与p-cofilin1表达下调(P<0.05)。表明DADS可增强沉默LIMK1抑制BGC823细胞迁移侵袭,机制可能与阻断Rac1/LIMK1/cofilin1通路有关。

DADS通过Rac1-ADF/cofilin1通路抑制人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭

目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)通过Rac1-ADF/cofilin1通路对人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭的作用。方法:划痕愈合和侵袭实验分别检测DADS对SW480细胞迁移与侵袭的影响;RT-PCR与Western blot检测DADS对SW480细胞Rac1-ADF/cofilin1信号分子表达的作用。结果:40与50 mg/L DADS处理SW480细胞24 h后,穿膜细胞分别减少57.12%与64.59%(P<0.05)。处理48 h细胞迁移率分别为23.23%与12.87%,较对照组75.86%明显降低(P<0.05)。RT-PCR显示,45 mg/LDADS处理SW480细胞24、48 h后,与对照组比较Rac1、Rock1、PAK1、LIMK1和destrin mRNA分别显著下调(P<0.01);而cofilin1mRNA无显著性差异(P>0.05)。Western blot显示,45 mg/L DADS处理SW480细胞6、12、24、48 h后,与对照组比较Rac1、Rock1、PAK1、LIMK1和destrin蛋白分别呈时间依赖性下调(P<0.05),但cofilin1蛋白无显著性差异(P>0.05),而p-LIMK1和p-cofilin1表达分别呈时间依赖性下调(P<0.05)。结论:DADS可通过Rac1-ADF/cofilin1通路下调Rac1、Rock1、PAK1、LIMK1、p-LIMK1、destrin与p-cofilin1抑制SW480细胞迁移与侵袭。

大黄酸调控Rac1/LIMK1/cofilin信号通路抑制卵巢癌细胞运动与侵袭

目的探讨大黄酸对卵巢癌淋巴结高转移SKOV3-PM4细胞运动和侵袭能力的影响,揭示大黄酸调控Rac1/LIMK1/cofilin信号通路与抑制卵巢癌细胞运动侵袭作用的机制。方法划痕实验观察大黄酸对卵巢癌细胞运动的影响,Matrigel-Transwell方法检测细胞侵袭能力,激光共聚焦扫描显微镜和扫描电镜观察大黄酸对卵巢癌细胞形态和细胞骨架超微结构的影响,Western blot分别检测Rac1/LIMK1/cofilin通路上Rac1、LIMK1、PAK1、cofilin蛋白的表达。结果与空白对照组相比,大黄酸能抑制SKOV3-PM4细胞侵袭和迁移能力,浓度为8.8、17.60、26.40μmol·L^(-1)的大黄酸处理24 h后,细胞体外迁移和侵袭能力均明显下降(P<0.05);细胞出现伪足减少,细胞内微丝断裂、分布紊乱,质膜凹凸不平、细胞间的间隙变宽等超微结构改变;Western blot结果表明大黄酸能明显下调Rac1蛋白的表达水平,并呈浓度依赖性。卵巢癌细胞经大黄酸及Rac1抑制剂处理后,磷酸化LIMK1、cofilin、PAK1蛋白水平与空白对照组比较明显下降,且大黄酸联合Rac1抑制剂处理后的磷酸化蛋白下调更为明显(P<0.05);而Rac1激活剂联合大黄酸组比大黄酸组磷酸化蛋白上调明显(P<0.05)。结论大黄酸为潜在的Rac1小分子抑制剂,其作用机制可能是调控Rac1/LIMK1/cofilin信号通路,抑制卵巢癌淋巴结转移细胞运动和侵袭的能力。

神经前体细胞表达发育下调蛋白9通过Rac1/Cdc42通路促进鼻咽癌细胞增殖和转移的机制研究

目的探究神经前体细胞表达发育下调蛋白9(neural precursor cell expressed developmentally downregulated protein 9,NEDD9)通过Rac1/Cdc42通路促进鼻咽癌细胞增殖和转移的机制。方法通过qPCR和Western blot检测人鼻咽上皮细胞NP69以及人鼻咽癌细胞系中NEDD9的表达水平。将CNE-1细胞分为NC组、NEDD9组和si-NEDD9组,分别转染空载质粒、NEDD9过表达和NEDD9沉默质粒。通过CCK-8法、细胞划痕实验和Transwell实验检测各组的细胞生长、迁移和侵袭能力。结果与NP69比较,人鼻咽癌细胞系中NEDD9 mRNA和蛋白的水平均显著上调(P<0.05),其中CNE-1细胞中NEDD9 mRNA和蛋白水平最高。与NC组比较,NEDD9组NEDD9 mRNA和蛋白的水平显著升高(P<0.05),si-NEDD9组NEDD9 mRNA和蛋白的水平显著降低(P<0.05)。NEDD9组细胞的增殖、迁移和侵袭能力以及Rac1/Cdc42通路水平显著高于NC组(P<0.05),si-NEDD9组的增殖、迁移和侵袭能力以及Rac1/Cdc42通路水平显著低于NC组(P<0.05)。结论 NEDD9在鼻咽癌细胞中过表达,并且NEDD9可能通过促Rac1/Cdc42通路诱导NPC细胞增殖和转移。

运动促进骨骼肌健康的新视角:基于Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路改善肌生成和糖代谢的研究进展与展望

骨骼肌是维持机体运动能力、调节机体能量代谢的重要器官,其内分泌功能也日益被重视。久坐、衰老、肥胖等因素会引起肌萎缩,继而影响糖脂代谢稳态,引起内分泌失调等相关疾病。抑制Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路能干预癌变,而激活该通路可控制骨骼肌生成、调节机体糖代谢。通过文献资料调研法分析了Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路的生理基础以及运动对其影响的可能性,系统阐述了运动调控Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路改善肌生成和糖代谢的潜在机制。研究认为,运动可通过Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路促进生肌决定因子的形成和葡萄糖转运蛋白4转位,从而促进骨骼肌再生,改善骨骼肌对葡萄糖的摄取能力。

川芎嗪通过Rac1/LIMK1通路减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤

目的:探讨川芎嗪(TMP)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)的预防作用及对Ras相关C3肉毒素底物1(Rac1)/LIM激酶1(LIMK1)信号通路的影响。方法:将C57BL/6小鼠随机分为6组:对照组、模型组(LPS组)、地塞米松(Dex)组及TMP(40、80和120 mg/kg)组。模型组小鼠第1次采用LPS腹腔注射,16 h后第2次采用气管滴注LPS诱导小鼠ALI模型;TMP组小鼠在LPS第1次腹腔注射前30 min及第2次气管滴注LPS后30 min时腹腔注射TMP;Dex组小鼠与TMP组同一时间腹腔注射3 mg/kgDex。LPS气管滴注24 h后检测小鼠外周血氧饱和度(SpO_(2));取小鼠肺组织,计算肺组织湿干重比值(W/D);ELISA法测定肺组织中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α);HE染色观察肺组织病理学变化;Westernblot检测肺组织中Rac1和LIMK1蛋白水平;支气管肺泡灌洗液中检测白细胞含量及蛋白浓度。结果:与对照组比较,模型组小鼠SpO_(2)降低(P<0.05),W/D升高(P<0.01),肺组织中IL-1β和TNF-α水平均升高(P<0.01);肺泡壁增厚,大量红细胞渗出,可见片状出血;支气管肺泡灌洗液中白细胞总数及蛋白浓度增高(P<0.01);Rac1和p-LIMK1蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组相比,Dex组和TMP组W/D降低(P<0.01),肺组织IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.01),肺泡间质水肿及出血减轻,红细胞渗出减少;支气管肺泡灌洗液中白细胞总数及蛋白浓度降低(P<0.01)。与模型组相比,Dex组及低、中剂量TMP组Rac1蛋白水平降低(P<0.01),p-LIMK1在Dex组及TMP组也显著降低(P<0.05,P<0.01),LIMK1在各组的表达无显著差异。结论:TMP可通过抑制Rac1/LIMK1信号通路降低毛细血管通透性,从而减轻LPS诱导的小鼠ALI。

Nck1蛋白通过Rac1-PAK1-MMP2信号通路对宫颈鳞癌组织血管生成的调控机制研究

目的Nck1蛋白通过Rac1-PAK1-MMP2信号通路对宫颈鳞癌组织血管生成的调控机制研究。方法回顾性选择2018年10月至2019年10月福建中医药大学附属人民医院的宫颈鳞癌病理组织标本80例,根据癌变组织是否发生侵袭分为侵袭组(n=38)与未侵袭组(n=42),另选择子宫颈鳞状上皮正常组织作为对照组(n=30)。采用免疫组织化学法检测3组标本中Nck1蛋白表达水平,利用免疫组织化学法观察侵袭组与非侵袭组标本中微血管密度(MVD)。通过制备Nck1过表达、低表达的宫颈癌细胞siHa,人脐静脉内皮细胞ECV304,测定宫颈癌细胞中Rac1、PAK1、MMP2表达水平,经Nck1过表达、低表达的siHa上清液干扰后的ECV304细胞增殖能力、血管形成能力、迁移能力。结果侵袭组Nck1蛋白表达水平明显高于非侵袭组与对照组,非侵袭组Nck1蛋白表达水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。侵袭组MVD与肿瘤直径明显大于非侵袭组,差异均有统计学意义(P<0.05)。宫颈鳞癌患者Nck1蛋白表达水平与MVD呈正相关关系(P<0.05)。Nck1过表达的siHa细胞中Rac1、PAK1、MMP2表达水平均明显高于Nck1低表达的siHa细胞,差异均有统计学意义(P<0.05)。经Nck1过表达的siHa细胞上清液干扰后的ECV304增殖率、迁移率、管腔形成数均高于经Nck1低表达的siHa细胞上清液干扰后的ECV304细胞,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论宫颈病理标本中Nck1蛋白处于高表达状态,其中已发生癌细胞侵袭、迁移的标本Nck1蛋白表达水平更高,过表达的Nck1能够促进血管内皮细胞增殖、迁移,这一作用机制与宫颈癌细胞中Rac1/PAK1/MMP2信号通路有关。

槲皮素通过Rac1/LIMK1/cofilin信号通路治疗抑郁症的机制研究

目的 探讨槲皮素(Que)对慢性不可预测轻度应激(CUMS)小鼠抑郁行为的影响和可能的作用机制。方法 将60只C57BL/6J小鼠随机分为对照组(Control组)、模型组(Model组)、氟西汀组(Positive组)、低浓度Que组(L-Que组)、高浓度Que组(H-Que组)。构建CUMS小鼠抑郁模型,给予不同浓度的槲皮素(20 mg·kg、40 mg·kg)灌胃治疗,氟西汀(10 mg·kg)作为阳性对照。通过体质量测量、糖水偏好实验、悬尾实验、强迫游泳行为学实验检测小鼠抑郁程度;尼氏染色检测小鼠海马神经元形态和数量;高尔基染色检测海马神经元树突棘形态;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测小鼠海马中脑源性神经营养因子(BDNF)、酪氨酸激酶受体B (TrkB)、突触素(SYP)及突触后致密物-95 (PSD-95)mRNA表达;Western blotting检测小鼠海马中BDNF、TrkB、SYP、PSD-95、Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)、LIM激酶1 (LIMK1)、p-LIMK1、丝切蛋白(cofilin)、p-cofilin蛋白水平。结果 与Control组比较,Model组小鼠体质量、糖水偏好百分比显著降低,悬尾和强迫游泳的不动时间显著增加(P<0.05);Model组小鼠海马神经元数量明显减少,尼氏小体部分消失或溶解,海马区树突棘密度显著减少,BDNF、TrkB、SYP、PSD-95 mRNA水平以及BDNF、TrkB、SYP、PSD-95、Rac1、p-LIMK1、p-cofilin蛋白水平均显著降低(P<0.05)。L-Que组和H-Que组显著改善了小鼠的抑郁样行为(P<0.05);与Model组比较,L-Que组和H-Que组小鼠海马神经元数量明显增多,树突棘密度升高,BDNF、TrkB、SYP、PSD-95 mRNA水平以及BDNF、TrkB、SYP、PSD-95、Rac1、p-LIMK、p-cofilin蛋白水平均显著升高(P<0.05)。结论 Que通过激活Rac1/LIMK1/cofilin通路增强突触可塑性从而改善小鼠抑郁样行为。

罗哌卡因抑制Rac1/JNK1/FAK通路的活化抑制黑色素瘤M21细胞生长、侵袭和迁移

目的:本文旨在探究罗哌卡因(ropivacaine,RPC)对黑色素瘤M21细胞生长,运动和上皮间质形态转换的影响。方法:采用0、0.25、0.5、1 mmol/L剂量罗哌卡因处理M21细胞,将细胞随机分为四组:RPC 0 mmol/L组、RPC 0.25 mmol/L组、RPC 0.5 mmol/L组和RPC 1 mmol/L组进行后续试验。EDU染色检测细胞生长;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Transwell检测侵袭细胞数;划痕试验检测细胞迁移;显微镜观察上皮间充质转化形态学变化;蛋白免疫印迹检测E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Rac1、JNK1、p-JNK1、FAK、p-FAK蛋白表达水平。结果:结果表明,与RPC 0 mmol/L组相比较,RPC 0.5、1 mmol/L组EDU阳性细胞数显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05),侵袭细胞数显著降低(P<0.05),划痕愈合率显著降低(P<0.05),上皮间充质转化受到抑制,E-cadherin蛋白表达水平显著升高(P<0.05),Vimentin、N-cadherin、Rac1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),p-JNK1/JNK1、p-FAK/FAK比值显著降低(P<0.05)。结论:罗哌卡因抑制Rac1/JNK1/FAK通路的活化调节黑色素瘤M21细胞生长,运动和上皮间质形态转换。

基于Rac1信号通路研究淫羊藿苷对慢性阻塞性肺疾病模型小鼠肺泡巨噬细胞胞葬及吞噬功能的影响

目的探讨淫羊藿苷基于Rac1信号通路改善慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)模型小鼠肺泡巨噬细胞胞葬及吞噬功能障碍的作用机制。方法40只C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、Rac1抑制剂(2.5 mg/kg)组和淫羊藿苷低、高剂量(40、80 mg/kg)组,每组8只,除空白组外其余各组小鼠采用香烟烟雾熏吸8周的方法制备COPD模型,造模后ip Rac1抑制剂或ig淫羊藿苷,1次/d,每周给药6次,连续4周。检测小鼠体质量、肺功能指标;ELISA法检测肺组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、IL-6、乳脂球表皮生长因子8(milk fat globule EGF factor 8,MFG-E8)和生长停滞特异性蛋白6(growth arrest specific protein 6,GAS6)含量;流式细胞术检测肺泡巨噬细胞胞葬及吞噬能力、小鼠全血巨噬细胞M1/M2分型;苏木素-伊红染色(hematoxylineosin staining,HE)观察肺组织病理变化及肺泡平均截距(mean linear intercept,MLI)、单位面积平均肺泡数(mean alveolar numbers,MAN);qRT-PCR和Western blotting分别检测肺组织Rac1、P21蛋白激活激酶(P21 activated kinase,PAK)m RNA和蛋白表达;激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞吞噬及骨架结构变化。结果与空白组比较,模型组小鼠体质量、肺功能指标、吞噬及胞葬功能降低(P<0.05、0.01),MLI上升(P<0.01),MAN降低(P<0.01),肺组织中炎症因子IL-4、IL-6、TNF-α水平上升(P<0.05、0.01),胞葬辅助因子MFG-E8、GAS6水平降低(P<0.05),M1型巨噬细胞增多(P<0.05),肺组织Rac1、PAK mRNA及蛋白表达上调(P<0.05、0.01);与模型组比较,Rac1抑制剂及淫羊藿苷干预后小鼠肺功能指标好转(P<0.05、0.01),吞噬及胞葬功能均有改善(P<0.05、0.01),炎症因子水平降低(P<0.05、0.01),胞葬辅助因子水平增加(P<0.05),M2型巨噬细胞增多(P<0.05、0.01),肺组织Rac1、PAK m RNA及蛋白表达降低(P<0.05、0.01)。结论淫羊藿苷可以调控Rac1信号通路介导巨噬细胞骨架重排,改善COPD小鼠肺泡巨噬细胞吞噬及胞葬功能障碍。

基于BDNF通路探讨樱桃叶水煎液对CUMS大鼠的抗抑郁作用机制

目的探讨樱桃叶水煎液对慢性不可预知性温和应激(CUMS)模型大鼠的抗抑郁作用及可能机制。方法将雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为空白组、CUMS模型组、盐酸氟西汀组(2 mg·kg^(-1))以及樱桃叶水煎液低、中、高剂量组(1.8、2.7、3.6 g·kg^(-1))。复制CUMS模型,采用强迫游泳实验、悬尾实验和糖水偏好实验观察大鼠行为学变化;酶联免疫吸附实验(ELISA)测定大鼠血清促肾上腺皮质激素(ACTH)含量;Western Blot法测定大鼠海马组织中脑源性神经营养因子(BDNF)、酪氨酸激酶受体B(TrkB)、Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1(Rac1)、LIM激酶1(LIMK1)、丝切蛋白(cofilin)的表达水平。结果(1)与空白组比较,CUMS模型组大鼠强迫游泳实验和悬尾实验的不动时间增加(P<0.01),糖水偏好系数下降(P<0.01);血清ACTH水平上调(P<0.01);海马组织BDNF、TrkB、Rac1、LIMK1、cofilin蛋白表达降低(P<0.01)。(2)与CUMS模型组比较,樱桃叶水煎液干预后大鼠强迫游泳实验和悬尾实验的不动时间减少(P<0.05,P<0.01),而糖水偏好系数上升(P<0.01);血清ACTH水平下降(P<0.01);海马组织BDNF、TrkB、Rac1、LIMK1、cofilin蛋白表达增强(P<0.05,P<0.01)。结论樱桃叶水煎液具有一定的抗抑郁作用,其机制可能与调节BDNF/TrkB及其下游的Rac1/LIMK1/cofilin信号通路有关。

SDF-1a模拟物CTCE-0214对重症肺炎的治疗作用及机制

目的探讨基质细胞衍生因子(SDF)-1a模拟物CTCE-0214(CTCE)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠重型肺炎(SP)的治疗作用及机制。方法将成年CD-1小鼠分为正常对照组、LPS组、LPS+CTCE组、LPS+SDF-1α组各12只。LPS组小鼠气管内滴注LPS(5 mg/kg),正常组小鼠气管内滴注生理盐水(5 mg/kg),LPS+CTCE组和LPS+SDF-1α组在小鼠滴注LPS(5 mg/kg)2 h后通过尾静脉注射CTCE或SDF-1α(10 mg/kg)。在LPS造模24 h后处死小鼠并收集肺组织和支气管肺泡灌洗液(BAL)。测定各组小鼠肺毛细血管通透性、肺含水量和BAL细胞数量,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BAL中白细胞介素(IL)-6、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α、MIP-2和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达水平,实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)检测肺组织中miR-126的表达水平,Western印迹检测肺组织中蛋白激酶B(AKT)、p-AKT和Rac1的表达水平。结果与正常对照组比较,LPS组肺毛细血管通透性、肺含水量和BAL细胞数量明显增加(均P<0.05),BAL中炎症因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表达水平明显升高(均P<0.05)。与LPS组比较,LPS+CTCE组和LPS+SDF-1α组肺毛细血管通透性、肺含水量和BAL细胞数量明显减少(均P<0.05),BAL中炎症因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表达水平明显降低(均P<0.05)。LPS组中miR-126表达水平较对照组明显降低(P<0.05),p-AKT和Rac1的表达水平较对照组明显增加(均P<0.05)。LPS+CTCE组和LPS+SDF-1α组较LPS组能够明显促进miR-126的表达水平及明显抑制p-AKT和Rac1的表达水平(均P<0.05)。在LPS+CTCE组小鼠尾静脉注射miR-126 inhibitors后能够明显增加肺毛细血管通透性、肺含水量和BAL细胞数量(均P<0.05),明显促进BAL中炎症因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α表达水平及增加p-AKT和Rac1表达水平(均P<0.05)。结论SDF-1a模拟物CTCE能够通过上调miR-126表达抑制AKT/Rac1信号通路,进而对SP发挥保护作用。

盐酸纳美芬对缺氧缺血性脑病新生大鼠Rac1/NOX2通路及神经细胞凋亡的影响

目的探究盐酸纳美芬对缺氧缺血性脑病(HIE)新生大鼠Ras相关C3肉毒素底物1(Rac1)/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NOX2)通路及神经细胞凋亡的影响。方法构建HIE新生大鼠模型,使用随机数字表法分为模型组,盐酸纳美芬低、中、高剂量(10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg,尾静脉注射)组,地塞米松组(阳性对照,6 mg/kg,腹腔注射),另取假手术组新生大鼠,每组20只,模型组和假手术组大鼠给予等剂量生理盐水,其余各组给予相对应剂量药物,每天1次,连续5 d。干湿比重法检测新生大鼠脑组织含水率;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法检测新生大鼠脑梗死面积;苏木精-伊红(H-E)染色法观察新生大鼠海马组织病理学变化;酶联免疫吸附法(ELISA)检测新生大鼠海马组织白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis Factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)含量;TUNEL染色检测新生大鼠神经细胞凋亡指数;蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测新生大鼠海马组织Rac1和NOX2蛋白表达水平。结果假手术组大鼠海马组织结构正常,未见明显病理损伤。与假手术组相比,模型组大鼠海马组织神经元体积增大,间质水肿,脑组织含水率、脑梗死面积、神经细胞凋亡指数、IL-1β含量、TNF-α含量、IL-6含量及Rac1和NOX2蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,盐酸纳美芬低、中、高剂量组大鼠海马组织病理损伤依次缓解,脑组织含水率、脑梗死面积、神经细胞凋亡指数、IL-1β含量、TNF-α含量、IL-6含量及Rac1和NOX2蛋白表达水平依次降低(P <0.05);盐酸纳美芬高剂量组与地塞米松组新生大鼠各项指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论盐酸纳美芬可能通过抑制Rac1/NOX2通路,减轻HIE新生大鼠海马组织炎症反应,减少神经细胞凋亡。

MEG3调控Rac1/Cdc42/PAK1信号通路在先天性巨结肠发病机制中的作用

目的 探讨LncRNA-MEG3及Rac1/Cdc42/PAK1信号通路在先天性巨结肠(Hirschsprung disease,HSCR)发病机制中的作用及机制。方法 收集2016年1月至2018年12月在遵义医科大学附属医院病理确诊HSCR并手术治疗的患儿结肠组织标本30例为实验组(HSCR组),其中男23例,女7例;年龄为(18.86±1.78)个月;体重为(4.56±0.19)kg。收集非先天性消化道畸形、非肠神经相关疾病手术切除肠管患儿14例组织标本为对照组(Normal组),包括坏死性小肠结肠炎、嵌顿疝和肠套叠造瘘患儿在闭瘘手术时吻合处正常肠管,其中男10例,女4例;年龄为(16.73±1.03)个月,体重为(5.01±0.20)kg。采用qRT-PCR和Western blot检测HSCR组与Normal组中MEG3和Rac1/Cdc42/PAK1信号通路各蛋白的表达水平。在SH-SY5Y细胞中通过转染MEG3过表达质粒以及加入通路抑制剂AZA1构建细胞模型,并分为4组:①空白对照组(Control组),仅有SH-SY5Y细胞;②空载体组(pcDNA3.1组),SH-SY5Y细胞+pcDNA3.1质粒;③MEG3过表达组(MEG3组),SH-SY5Y细胞+pcDNA3.1-MEG3质粒;④抑制剂组(MEG3+AZA1组),SH-SY5Y细胞+pcDNA3.1-MEG3+AZA1抑制剂。采用Western blot、CCK-8和Transwell方法检测各组细胞中Rac1、Cdc42、PAK1及P-PAK1蛋白表达量以及细胞增殖和迁移能力。两组间数据在进行方差同质性检验后采用两独立样本t检验比较,多组数据之间的比较采用单因素方差分析。若总体方差不齐,采用修正的界限值或Tamhane's T2检验;非正态分布的计量资料,采用多独立样本比较的秩和检验。结果 HSCR患儿狭窄段肠管组织中MEG3、Rac1、Cdc42、PAK1和P-PAK1蛋白表达量均较Normal组低(Rac1:0.20±0.05比0.78±0.05,t=8.37;Cdc42:0.38±0.08比1.03±0.08,t=5.68;PAK1:0.27±0.02比1.10±0.06,t=13.52;P-PAK1:0.24±0.03比1.07±0.06,t=12.99;P均<0.01);在细胞模型中,MEG3组细胞中Rac1、Cdc42、PAK1和P-PAK1蛋白相对表达量均高于Control组和MEG3+AZA1组(Rac1:0.96±0.05比0.36±0.11比0.75±0.20,F=3.46,P<0.05;Cdc42:1.12±0.08比0.53±0.19比0.68±0.10,F=5.37,P<0.01;PAK1:1.02±0.09比0.55±0.14比0.47±0.14,F=5.60,P<0.05;P-PAK1:0.97±0.07比0.66±0.08比0.47±0.03,F=15.66,P<0.05),MEG3组细胞中MEG3表达量明显高于Control组和pcDNA3.1组(1.00±0.20比0.14±0.04比0.02±0.01,F=20.56,P<0.01),Control组和pcDNA3.1组中MEG3相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。MEG3组细胞增殖能力高于Control组及MEG3+AZA1组(12 h:0.19±0.00比0.19±0.00比0.18±0.00,P>0.05;24 h:0.21±0.00比0.19±0.01比0.17±0.00,F=12.00,P<0.01;48 h:0.30±0.02比0.26±0.00比0.22±0.01,F=9.60,P<0.05)。MEG3组细胞迁徙数量明显高于Control组(141.67±11.93比96.33±8.02,t=3.15,P<0.05),MEG3+AZA1组细胞迁徙数量低于MEG3组和Control组(71.00±7.00比141.67±11.93比96.33±8.02,F=15.04,P<0.01)。结论 低表达的MEG3可能通过调控Rac1/Cdc42/PAK1信号通路抑制神经嵴细胞增殖和迁移能力,可能与HSCR发生有关。

PSD-95/Kalirin-7/Rac1信号通路对不同浓度七氟烷吸入麻醉大鼠胃癌根治术后神经功能的影响

目的探讨突触后致密蛋白95(postsynaptic density protein-95, PSD-95)/Kalirin-7/Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)信号通路对不同浓度七氟烷吸入麻醉大鼠胃癌根治术后神经功能的影响。方法 Wistar大鼠52只,随机选取9只为正常组,其余43只制备胃癌模型并将存活的40只随机分为模型组和七氟烷低、中、高浓度组各10只。七氟烷低、中、高浓度组分别吸入体积分数1%、3%、5%七氟烷麻醉后行胃癌根治术,正常组和模型组不行手术。比较5组术后谵妄情况、Bederson神经功能评分、海马组织病理变化情况、海马组织PSD-95、Kalirin-7蛋白相对表达量和磷酸化Rac1(phosphorylated-Rac1, p-Rac1)/Rac1。结果大鼠周边运动格数和中央跨格次数随七氟烷浓度增高而增加(P<0.05),中央停留时间随七氟烷浓度增加而延长(P<0.05),且不同浓度七氟烷组均大于模型组和正常组(P<0.05)。术后1、3、5 d,七氟烷高浓度组Bederson神经功能评分[(2.15±0.31)、(2.85±0.31)、(3.24±0.32)分]均高于七氟烷中浓度组[(1.64±0.17)、(2.26±0.23)、(2.70±0.28)分]和七氟烷低浓度组[(1.02±0.13)、(1.57±0.16)、(2.03±0.21)分](P<0.05),七氟烷中浓度组高于七氟烷低浓度组(P<0.05);随术后时间延长,七氟烷低、中、高浓度组Bederson神经功能评分均逐渐升高,不同时间点比较差异均有统计学意义(P<0.05)。HE染色结果显示,正常组与模型组神经元排列整齐,大部分神经元形态、结构正常;七氟烷低、中、高浓度组海马神经元排列紊乱,部分神经元胞体变小,有较多神经元发生不同程度固缩与深染,随七氟烷浓度增高改变更为明显。PSD-95蛋白、Kalirin-7蛋白相对表达量,p-Rac1/Rac1随七氟烷浓度增加而降低(P<0.05),均低于模型组和对照组(P<0.05)。结论七氟烷可导致大鼠胃癌根治术后谵妄及神经功能障碍,且呈剂量依赖性,其作用机制可能与抑制PSD-95/Kalirin-7/Rac1信号通路有关。

川芎嗪对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞高通透性的保护作用研究

目的:观察川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)通透性变化和细胞骨架相关蛋白表达影响。方法:以体外培养的HUVECs为实验对象,将细胞随机分6组:正常对照组,LPS组(1μg/mL LPS),TMP低、中、高剂量防治组(60μg/mL TMP+1μg/mL LPS、120μg/mL TMP+1μg/mL LPS、240μg/mL TMP+1μg/mL LPS),纯TMP组(240μg/mL TMP)。Transwell小室内建立内皮细胞通透性模型;细胞电压电阻仪测定各组细胞跨内皮细胞电阻值(TEER);FITC-葡聚糖法检测各组细胞通透性变化,Pull-Down实验拉下Rac1-GTPase活性蛋白,Western blotting检测各组细胞Rac1-GTPase、Rac1、LIMK1和p-LIMK1的蛋白表达。结果:3组不同浓度的TMP均可以抑制LPS诱导的内皮细胞TEER降低以及降低LPS导致的内皮细胞通透性的增加(P<0.05~P<0.01);Western blotting实验显示TMP可以有效抑制LPS诱导的HUVECs中的Rac1-GTPase、p-LIMK1、Rac1、LIMK1表达(P<0.05~P<0.01)。结论:TMP可以有效抑制LPS诱导的HUVECs通透性升高,其机制可能与其下调Rac1/LIMK1信号通路中Rac1-GTPase活性蛋白、LIMK1磷酸化蛋白表达有关。

补肾活血汤抑制糖尿病肾病引起的足细胞损伤及EMT发生机制研究

[目的]观察补肾活血汤对高糖诱导的小鼠足细胞损伤及上皮间充质转化(EMT)的影响,并探讨其对足细胞损伤及发生EMT的作用机制。[方法]体外培养永生化的小鼠足细胞系MPC5,分为对照组、高糖组及补肾活血汤组,经相应处理48h后,采用噻唑蓝(MTT)法检测各组足细胞增殖情况,采用流式细胞术检测各组足细胞凋亡情况,采用Transwell和划痕实验检测各组足细胞体外迁移能力,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测各组足细胞标志P-cadherin、ZO-1及EMT发生过程标志desmin、FSP-1的相对表达量。在高糖诱导的足细胞中分别加入Rac1抑制剂NSC23766或Rac1激活剂PMA,采用Westernblot检测不同处理组足细胞中GTP-Rac1、p-PAK1、p-p38、p-β-catenin、p65蛋白表达水平。[结果]与对照组相比,高糖处理可抑制足细胞增殖,诱导足细胞凋亡,促进细胞的迁移及EMT的发生,差异具有统计学意义(P<0.05)。补肾活血汤可缓解由高糖诱导的足细胞的增殖抑制作用,降低高糖诱导的细胞损伤、凋亡、迁移,逆转EMT的发生,差异具有统计学意义(P<0.05)。补肾活血汤通过调控GTP-Rac1、p-PAK1、p-p38、p-β-catenin、p65蛋白表达水平,影响Rac1及其下游信号通路的活化。[结论]高糖可导致小鼠足细胞损伤及EMT的发生,补肾活血汤可抑制高糖诱导的足细胞损伤及EMT的发生,其作用机制是补肾活血汤通过调控Rac1及下游信号通路,起到保护足细胞损伤的作用。

环状RNA circWHSC1在结肠癌的表达及相关分子机制研究

目的探讨环状RNAcircWHSC1在结肠癌发生发展过程中的作用及其相关分子机制。方法选取2017-01-01-2021-01-31郑州人民医院病理确诊为结肠癌的60例患者癌及癌旁组织(距癌旁≥5cm),按照circWHSC1表达水平将患者分为高表达组(≥3.44,33例)与低表达组(<3.44,27例)。Kaplan-Meier plotter法分析circWHSC1表达与患者预后生存的关联性。通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测circWHSC1、miR-142-3p和RAC1的表达;采用蛋白质印迹法、CCK-8和Transwell检测其蛋白的表达、细胞的增殖和转移能力;双荧光素酶报告基因和RT-PCR验证circWHSC1、miR-142-3p和RAC1三者之间的作用关系。结果circWHSC1在结肠癌患者癌组织(3.74±1.60)中的表达高于癌旁组织(1.07±0.58),t=7.572,P<0.001;与circWHSC1低表达组相比,circWHSC1高表达组结肠癌患者的生存时间缩短,χ^(2)=12.321,P<0.001。结肠癌细胞系HCT116的circWHSC1表达量最高,F=29.380,P<0.001。敲低circWHSC1可抑制HCT116细胞的增殖(t=12.775,P<0.001)、迁移(t=46.973,P<0.001)和侵袭能力(t=40.935,P<0.001)。双荧光素酶报告基因显示,circWHSC1与miR-142-3p具有靶向关系,而敲低circWHSC1可增加HCT116细胞中miR-142-3p表达水平,t=17.705,P<0.001。在敲低circWHSC1基础上应用miR-142-3p抑制剂则可以增强HCT116细胞的增殖(t=7.304,P=0.002)、迁移(t=16.049,P<0.001)和侵袭能力(t=14.994,P<0.001)。miR-142-3p在结肠癌患者癌组织中的表达低于癌旁组织,t=12.599,P<0.001。双荧光素酶报告基因实验证实,RAC1为miR-142-3p的靶基因,过表达miR-142-3p可抑制HCT116细胞中RAC1蛋白表达水平(t=25.162,P<0.001),并且发现,在敲低circWHSC1基础上过表达RAC1同样可以增强HCT116细胞的增殖(t=7.658,P=0.002)、迁移(t=62.626,P<0.001)和侵袭能力(t=58.596,P<0.001)。RAC1在结肠癌患者癌组织中的表达同样高于癌旁组织(t=14.873,P<0.001),敲低circWHSC1可在抑制HCT116细胞中RAC1表达的同时,抑制其下游PAK1蛋白RAC1、PAK1及p-PAK1的表达和激活,t值分别为7.506、15.588和6.795,P值分别为0.001、<0.001和0.002。结论circWHSC1可能通过调控miR-142-3p/RAC1/PAK1轴参与结肠癌的发生过程,为未来临床结肠癌早期诊断和治疗提供新的靶点。

膜突蛋白磷酸化在大鼠肺微血管内皮细胞损伤中的作用机制探讨

目的 观察肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）损伤中膜突蛋白（Moesin）磷酸化水平的变化,探讨Rac1信号通路对Moesin磷酸化的影响.方法 体外培养大鼠PMVECs并传至第3代,分别进行TNF-α时效实验、量效实验以及Rac1信号通路干预实验.① 时效实验：以10μg/L TNF-α分别刺激大鼠PMVECs 0、15、30 min和1、3、6、12 h后,采用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测Moesin和磷酸化Moesin（p-Moesin）的蛋白表达.② 量效实验：分别以0、0.1、1、10μg/L TNF-α刺激大鼠PMVECs 6 h后,采用Western Blot检测Moesin和p-Moesin的蛋白表达.③Rac1信号通路干预实验：在PMVECs细胞中分别给予3 mL 200μmol/L的Rac1特异性抑制剂NSC23766预孵0.5 h或200μmol/L的Rac1特异性激动剂O-Me-cAMP预孵1 h,再分别与10μg/L的TNF-α共孵育6 h;同时设立空白对照组及O-Me-cAMP、NSC23766、TNF-α单独处理组;采用Western Blot检测Moesin和p-Moesin的蛋白表达.结果 ① 时效实验结果：以10μg/L TNF-α与大鼠PMVECs共孵育后各时间点Moesin表达量无明显变化;而TNF-α诱导15 min时,p-Moesin表达量即较0 min迅速升高（p-Moesin/Moesin：4.399±0.523比1.000±0.195）,30 min达高峰（6.069±0.557）,1 h后逐渐下降（1、3、6、12 h分别为5.005±0.544、4.599±0.478、1.742±0.288、1.503±0.352）,各时间点间差异有统计学意义（F=15.397,P=0.002）.② 量效实验结果：各剂量TNF-α与大鼠PMVECs共孵育6 h时Moesin表达量无明显变化;而以0.1μg/L TNF-α诱导的p-Moesin表达量即较0μg/L显著升高（p-Moesin/Moesin：2.194±0.430比1.000±0.273）,且随TNF-α剂量增加呈持续升高趋势（1μg/L和10μg/L分别为3.201±0.688、4.413±0.296）,各剂量组间差异有统计学意义（F=92.513,P〈0.001）.③Rac1信号通路干预实验结果：各组间Moesin表达量无明显差异.与空白对照组比较,Rac1特异性激动剂O-Me-cAMP或Rac1特异性抑制剂NSC23766单独刺激均不能改变p-Moesin表达;而TNF-α可诱导p-Moesin表达.与TNF-α组比较,NSC23766可显著上调TNF-α诱导的p-Moesin表达（p-Moesin/Moesin：2.612±0.355比1.911±0.297,P〈0.05）;而O-Me-cAMP则呈现显著下调作用（p-Moesin/Moesin：1.928±0.331比3.030±0.353,P〈0.05）.结论 Moesin的磷酸化参与了TNF-α诱导的大鼠PMVECs损伤;通过调控Rac1信号通路中的Moesin磷酸化表达可以减轻PMVECs损伤.