猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白与RACK1蛋白相互作用的研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)编码的非结构蛋白NSP9为参与病毒复制的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),而宿主蛋白与RdRp相互作用参与病毒基因组的复制机理尚不明确。为筛选与RdRp相互作用的宿主蛋白,本研究以PPRSV NSP9蛋白为"诱饵",利用酵母双杂交方法筛选猪肺泡巨噬细胞cDNA酵母表达文库,筛选结果显示PRRSV NSP9蛋白与宿主蛋白RACK1具有相互作用关系。进一步经酵母共转化试验和免疫共沉淀试验验证RACK1和NSP9特异性结合,并共定位于细胞浆中。研究结果表明,宿主蛋白RACK1是PRRSV NSP9蛋白的一种新的相互作用蛋白,然而RACK1参与PRRSV复制的详细机理有待深入研究。

猪脑心肌炎病毒2B蛋白与RACK1蛋白相互作用的鉴定

为筛选与猪脑心肌炎病毒(EMCV)2B蛋白相互作用的宿主蛋白,本实验利用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞表达文库制备与EMCV 2B蛋白相互作用的宿主蛋白RACK1蛋白。酵母共转化试验和免疫共沉淀试验表明两者可以特异性结合,激光共聚焦试验表明两者共定位于细胞质中。为定位RACK1与2B蛋白相互作用区域,本研究构建了RACK1截短表达重组质粒,并将其与pCAGGS-Flag-2B共转染HEK293细胞,利用免疫共沉淀试验验证其相互作用区域。结果显示2B蛋白与宿主细胞RACK1蛋白存在相互作用,并且证明相互作用区域位于RACK1蛋白的N端。

RACK1蛋白在毕赤酵母GS115中的表达研究

本文克隆得到了拟南芥和水稻的活化态C激酶1受体基因,AtRACK1/OsRACK1,用电转化的方法成功将AtRACK1/OsRACK1基因整合到毕赤酵母GS115的染色体上,经菌体培养和甲醇诱导后获得了有效分泌表达,表达产物存在于培养液上清中,表达蛋白经SDS-PAGE鉴定显示其分子量为36kD左右,在诱导72小时后AtRACK1/OsRACK1蛋白表达量最大,该结果为进一步纯化RACK1蛋白,获得植物RACK1蛋白抗体奠定了基础.

非小细胞肺癌患者HPV感染与RACK1蛋白表达的相关性研究

目的探讨活化的蛋白激酶C受体(Receptor for activated Ckinase 1,RACK1)在非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)患者人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染中的表达情况,分析RACK1蛋白表达与NSCLC患者HPV感染的相关性。方法选取2016年4月-2018年3月曲靖市第一人民医院62份NSCLC病理标本为试验组,同期选取36份癌旁组织为对照组。免疫组化法检测RACK1蛋白及HPV L1壳蛋白表达情况,双变量Spearman相关性分析NSCLC患者HPV感染与RACK1蛋白表达的相关性。结果试验组HPV感染率、RACK1蛋白阳性检出率均高于对照组(P<0.05);HPV感染NSCLC患者中RACK1蛋白阳性检出率高于未HPV感染患者(P<0.05);经Spearman相关性分析检验证实,NSCLC患者HPV感染与RACK1蛋白阳性呈正相关(r=0.547,P<0.001)。结论 HPV感染可能是非小细胞肺癌发生发展的病毒学因素,患者一旦合并HPV感染将上调其RACK1蛋白表达,激活下游信号通路,使细胞发生凋亡抵抗,考虑可将RACK1蛋白早期检测作为非小细胞肺癌患者新型标志物。

活化的蛋白激酶C受体1真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建活化的激酶C受体1(RACK1)WD1-4真核表达载体,通过细胞转染和Western blot鉴定其是否在细胞中表达。方法:应用PCR法扩增RACK1蛋白中第1～4个WD40区域的片段,将其与PGEM-T载体连接,测序后再将其克隆至pEGFP-N1中。采用脂质体法将重组质粒转染至293T细胞中,观察其在真核细胞中的表达,并用Western blot法进行鉴定。结果:pEGFP-N1-RACK1(WD1-4)重组质粒经酶切鉴定及测序证实,目的基因的序列完全正确。荧光显微镜观察发现,转染了重组质粒的细胞株可见绿色荧光融合蛋白的表达,Western blot结果进一步证实了上述结果。结论:成功构建pEGFP-N1-RACK1(WD1-4)重组质粒且进行了真核表达,为下一步研究RACK1蛋白的功能奠定了基础。

羽衣甘蓝BoRACK1基因克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】克隆羽衣甘蓝蛋白激酶C1受体(RACK1)基因(BoRACK1)序列,并对其进行亚细胞定位及表达分析,为研究RACK1基因在植物生长发育过程中的调控机制提供理论参考。【方法】PCR扩增BoRACK1基因,构建其亚细胞定位表达载体,通过基因枪法转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GEP)的分布情况。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BoRACK1基因在不同组织中及在非生物胁迫(200 mmol/L NaCl、100μmol/L ABA和1 mmol/L H2O2溶液)下幼苗中的表达情况。【结果】PCR扩增获得BoRACK1基因的开放阅读框(ORF)序列,其cDNA全长980 bp,编码326个氨基酸,氨基酸序列与其他植物的RACK1具有较高同源性,在65%以上,尤其与拟南芥的同源性高达93%。BoRACK1基因在羽衣甘蓝的根、茎、叶、花和种子中均有表达,其中在根、叶和种子中的表达量较高,而在花、幼芽和茎的表达量较少。BoRACK1基因在ABA、H_2O_2和NaCl胁迫下的表达量整体上呈下调趋势,其中NaCl胁迫下其表达量在6 h时降至最低,而其他胁迫下其表达量均在4 h时降至最低。BoRACK1定位于细胞质、细胞核和细胞质膜。【结论】BoRACK1基因表达无组织特异性,除了与羽衣甘蓝花、果实及营养器官的发育存在关联外,还可能参与了植物的抗逆性调控过程。

拉喹莫德抑制成骨细胞中缺氧诱导因子2α的表达及其功能

背景:由于骨折会诱导骨细胞缺氧,使骨细胞中的氧张力明显下降,现已证明,其中低氧诱导因子2α是机体在低氧状态下调剂机体功能的一种重要氧依赖转录激活因子,其介导骨折发生时多种炎性因子的释放。目的:探讨拉喹莫德对成骨细胞中缺氧诱导因子2α的表达和功能的影响。方法:缺氧处理前分别在蛋白酶体抑制剂MG132或N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨酸存在和不存在的情况下,用10-100μmol/L的拉喹莫德处理小鼠成骨细胞MC3T3-E1(克隆14)。然后分别在体积分数1%或21%氧张力下进行1-24 h的预处理。结果与结论:(1)缺氧诱导因子2α在成骨细胞缺氧中表达明显增高。而拉喹莫德可以抑制成骨细胞中缺氧诱导因子2α及其目标基因在小鼠成骨细胞(MC3T3-E1细胞)中的表达。(2)拉喹莫德以蛋白酶依赖、von Hippel-Lindau(VHL)蛋白不依赖的方式促进缺氧诱导因子2α的降解,可打断缺氧诱导因子2α和它的分子伴侣热休克蛋白90之间的相互作用,促进缺氧诱导因子2α和激活的蛋白酶C受体之间的相互作用。(3)结果显示拉喹莫德可能通过影响缺氧诱导因子2α蛋白的折叠和成熟从而促进其降解,可通过改变与伴侣蛋白热休克蛋白90和RACK1的功能性相互作用来抑制成骨细胞中的缺氧诱导因子2α。

大鳞副泥鳅和泥鳅GNB2L1基因的克隆、表达及系统进化分析

由G蛋白D2亚基类似物1基因（GNB2L1）编码的蛋白激酶C受体（RACKl）是一个高度保守的锚定蛋白，属于WD40结构域蛋白家族成员，在细胞信号转导等生命过程中发挥着重要作用。本文采用RACE技术和基因克隆技术分别对大鳞副泥鳅（Paramisgurnusdabryanus）和泥鳅（Misgurnusanguillicaudatus）精巢组织的GNB2L1基因cDNA序列进行了克隆。序列分析表明，大鳞副泥鳅GNB2L1基因cDNA序列全长1115bp，开放阅读框（ORF）长965bp，编码317个氨基酸；泥鳅GNB2L1基因cDNA序列的开放阅读框长965bp，编码317个氨基酸；两种泥鳅GNB2L1基因编码的蛋白与其他鱼类的RACK1蛋白的同源性为94％～97％，且不同进化地位物种的GNB2L1基因均由8个外显子和7个内含子组成。以GNB2LI基因为标记基因，构建的鱼类系统发育树显示，大鳞副泥鳅和泥鳅在进化上的亲缘关系最近。RT．PCR结果显示，GNB2LI基因在大鳞副泥鳅成体各组织中均有表达，且在脑组织的表达量高于其他组织。以上结果表明，GNB2L1基因为一个进化保守基因，可能在大鳞副泥鳅的细胞活动中发挥着重要作用。