NKG2D及其配体RAE-1、H60在移植物抗肿瘤中的作用

为探讨NKG2D及其配体RAE-1、H60在单倍体相合(haploidentical)造血干细胞移植介导的移植物抗肿瘤效应中的作用,以皮下接种H22细胞的BABL/c×C57BL/6杂交F1代(CB6F1)小鼠为受鼠,以C57BL/6小鼠的骨髓+脾细胞为供者细胞,分别用抗CD90.2、NK1.1和NKG2D单克隆抗体清除供者T细胞、NK细胞和封闭NKG2D受体,进行单倍体相合细胞移植,观察移植后的抗肿瘤效应,并以半定量RT-PCR法检测移植后小鼠肿瘤组织RAE-1、H60的mRNA表达水平。结果发现:清除供者T细胞、NK细胞和封闭NKG2D的移植均导致移植物抗肿瘤效应的下降,MHC单倍体相合细胞移植后肿瘤细胞RAE-1、H60的mRNA表达水平上升。结论:NKG2D及其配体RAE-1、H60在移植物抗肿瘤效应中的起着重要的作用。

大鼠肺泡II型上皮细胞系RAE-1的建立及其生物学特性

建立肺泡II型细胞系为研究细胞恶性转化提供实验模型。采用Nycodenz密度梯度离心法分离了大鼠肺泡II型上皮细胞 ,原代培养大鼠肺泡II型上皮细胞并将SV4 0病毒的早期区大T基因转导入上皮细胞 ,建立了可在体外长期稳定传代的细胞系RAE - 1。对此细胞系的生物学特性分析表明 :细胞的基因组中整合了SV4 0T基因 ;染色体分析以非整倍体为主 ,众数染色体为 4 4条 ;细胞不能在软琼脂上形成克隆 ;除了转化特性以外 ,RAE - 1细胞仍保留了正常的上皮组织角蛋白Ck8。

NKG2D/RAE-1通路在介导NK/T细胞杀伤垂体瘤细胞中的作用及意义

目的观察NKG2D/RAE-1通路在介导自然杀伤(NK)细胞、CD8^+T细胞(两种细胞简称NK/T细胞)杀伤垂体瘤细胞中的作用,从细胞学水平探讨垂体瘤的免疫逃逸机制。方法以小鼠垂体瘤细胞系At T20为研究对象,采用免疫荧光标记法检测NKG2D配体RAE-1在垂体瘤细胞的表达水平及定位分布情况。采用NK/T细胞分选试剂盒分离NK/T细胞,将NK/T细胞放入Transwell小室的上室,靶细胞At T20置入Transwell小室的下室,随机分为对照组、实验组。对照组在常规条件下共培养0、4、8、24 h,实验组在培养液中加入阻断RAE-1的抗体(AntiRAE1抗体)共培养0、4、8、24 h;采用MTT法检测两组各时间点细胞增殖抑制率。结果 RAE-1在At T20细胞膜明显表达,在细胞质内亦有弱表达。在At T20细胞中RAE-1蛋白阳性表达率为100%,其中强表达率为30%、中表达率为60%、弱表达率为10%,无阴性表达。对照组培养4、8、24 h时细胞增殖抑制率明显高于0 h时(P均<0.05);实验组培养0、4、8、24 h时增殖抑制率逐渐升高(P均<0.05),培养8、24 h时增殖抑制率均明显高于同时间点对照组(P均<0.05)。结论 NK/T细胞通过NKG2D/RAE-1通路杀灭垂体瘤细胞,RAE-1可负反馈作用于NK/T细胞,从而抑制免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。NKG2D/RAE-1通路可能作为垂体瘤的免疫治疗靶点。

香砂六君子汤合除痰解毒中药对Lewis肺癌小鼠免疫逃逸的影响

目的:观察香砂六君子汤合除痰解毒中药对Lewis肺癌小鼠免疫逃逸的作用及机制。方法:取60只SPF级C57BL/6J雄鼠,于右侧腋中线皮下注射Lewis细胞悬液0.2 m L(含细胞数2×10^(6)个/m L),接种7 d后,将造模成功的小鼠随机分为模型组、顺铂组、香砂六君子汤低、中、高剂量组、联合组,每组10只。香砂六君子汤低、中、高剂量组分别灌胃17.88、35.75、71.50 g·kg^(-1)香砂六君子汤加减溶液,1次/d,顺铂腹腔注射小鼠用量换算为5 mg·kg^(-1),2次/周,各组均连续干预14 d,每2 d测量肿瘤体积。治疗结束后称取各组小鼠肿瘤质量并计算抑瘤率;苏木素-伊红(HE)染色观察各组肿瘤的形态学特征;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组肿瘤组织中自然杀伤(NK)细胞杀伤受体2(NKG2D)、核糖核酸输出因子-1(RAE-1)、γ干扰素(IFN-γ)mRNA含量;免疫组化法(IHC)、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组肿瘤RAE-1、NKG2D、IFN-γ表达;Western blot检测各组小鼠肿瘤中IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及脾脏组织中NKG2D、RAE-1蛋白含量。结果:与模型组比较,香砂六君子汤各剂量组肿瘤质量均下降,差异无统计学意义;肿瘤体积均缩小(P<0.05,P<0.01);病理学形态改善;香砂六君子汤中剂量组NKG2D、RAE-1、IFN-γ mRNA含量均升高(P<0.05,P<0.01),肿瘤组织中NKG2D、RAE-1、IFN-γ蛋白表达均升高(P<0.05,P<0.01),p-JAK2、p-STAT3蛋白表达下降(P<0.05,P<0.01);脾脏组织中,香砂六君子汤各剂量组NKG2D、RAE-1蛋白表达均显著升高(P<0.01)。与顺铂组比较,香砂六君子汤中剂量组NKG2D、RAE-1、IFN-γ mRNA含量升高,差异无统计学意义;IHC显示联合组NKG2D、IFN-γ蛋白表达显著升高(P<0.01),Western blot结果表明RAE-1、NKG2D、IFN-γ蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01);联合组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达下降(P<0.05,P<0.01);脾脏组织中,香砂六君子汤中剂量组、联合组NKG2D、RAE-1蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论:香砂六君子汤合除痰解毒中药能够通过上调RAE-1/NKG2D表达,促进NK细胞活化,抑制免疫逃逸,抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长,其机制可能与下调JAK2/STAT3通路相关。

NKG2D配体在小鼠异位气管移植模型中的作用

目的 观察小鼠异位气管移植后不同时间点NKG2D配体Rae-1和H60表达水平的变化，探讨其在肺移植后闭塞性细支气管炎（BOS）中的重要作用。方法 建立小鼠异位气管移植模型并于术后7、14、28 d取材。苏木素-伊红（HE）和Mallory染色形态学观察，并检测术后气管闭塞率，实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测不同时间点移植物Rae-1和H60的mRNA表达；免疫组织化学检测不同时间点移植物的Rae-1和H60蛋白表达。结果 移植后随时间延长，HE染色提示BOS病理学不断进展，与对照组比较，气管移植物14 d和28 d管腔闭塞率不断增加[（30.82±7.61）%和（83.52±13.12）%比（3.75±1.78）%，P＝0.012、0.007]，Mallory染色和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达不断增强。RT-qPCR检测结果显示与对照组比较，移植后小鼠气管移植物14 d的H60（12.712 2±2.828 0比0.739 6±0.042 8，P＝0.014）和28 d的Rae-1 mRNA（10.464 9±2.109 1比0.617 6±0.041 3，P＝0.022）表达强度均明显提高。免疫组织化学检测结果显示气管移植物H60和Rae-1在蛋白水平表达分别在14 d（207.97±25.87比31.63±9.42，P＝0.023）和28 d（185.34±24.06比32.84±7.85，P＝0.026）明显高于对照组。结论 NKG2D配体可能参与了肺移植后BOS的发生发展，加强主要组织相容性Ⅰ类相关基因（MIC）配型或特意性阻断NKG2D通路有可能延缓并减少肺移植后BOS的产生。

地高辛对非霍奇金淋巴瘤raji细胞侵袭能力的影响及作用机制研究

目的了解强心苷类药物地高辛对非霍奇金淋巴瘤raji细胞侵袭能力的影响,并对其作用机制进行初步探讨。方法选取河北医科大学第四医院病理科2010年10月至2013年12月手术切除的非霍奇金淋巴瘤组织标本30例,采用免疫组化S-P方法检测非霍奇金淋巴瘤T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam-1)及Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac-1)蛋白表达情况;通过细胞侵袭实验以及实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测不同浓度地高辛作用于raji细胞后Tiam-1、Rac-1表达水平变化。结果免疫组化结果显示,非霍奇金淋巴瘤中Tiam-1蛋白染色阳性率(70%)及Rac-1蛋白染色阳性率(73.33%)均高于正常淋巴结组织,差异有统计学意义(P<0.05)。相关分析结果显示,Tiam-1及Rac-1具有相关性,相关系数r=0.757(P<0.01)。细胞侵袭实验结果显示,不同浓度组地高辛作用raji细胞48 h后,随着作用浓度的增加侵袭率下降,差异有统计学意义(P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,不同浓度的地高辛分别作用于raji细胞48 h,各组之间Tiam-1及Rac-1的相对表达量差异有统计学意义(P<0.05),并随着作用浓度的增加相对表达量降低。结论强心苷类药物地高辛可通过调节Tiam-1及Rac-1因子的表达对淋巴瘤侵袭及转移起到一定抑制作用。