脊髓损伤继发骨质疏松大鼠骨髓基质细胞OPG、RANKL基因表达特点

目的:了解脊髓损伤继发骨质疏松大鼠骨髓基质细胞成骨能力及其OPG、RANKL基因表达的特点,以探索脊髓损伤继发骨质疏松发病机制。方法:60只SD大鼠按体重随机分为6组,对20只采用脊髓横断法在T10处横断脊髓制作完全性SCI模型,分为SCI6周和12周组;20只在同水平处切断棘突、椎板制作假手术对照组(sham),分为Sham6周和12周组;另20只分为正常6周和12周对照组。分别在SCI后6周和12周时取材,行骨髓基质细胞培养,并检测其成骨能力及OPG、RANKL基因表达。结果:脊髓损伤6周、12周时,大鼠骨髓基质细胞成骨能力无明显变化,其OPG基因表达无明显改变;脊髓损伤6周时,其RANKL基因表达和RANKL/OPG明显升高。结论:骨髓基质细胞RANKL基因表达和RANKL/OPG升高可能是脊髓损伤后早期大鼠发生骨质疏松的主要原因。

hsa-miR-655靶向CLCF1基因对人成骨肉瘤MG63细胞OPG/RANKL系统表达的影响

目的探讨hsa-miR-655通过靶向调控心肌营养素样细胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1,CLCF1)基因表达,对人成骨肉MG63细胞系增殖、护骨素(osteoprotegerin,OPG)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)表达的影响。方法通过hsa-miR-655慢病毒转染MG63细胞进行功能获得实验。实验分阴性对照组(NC组)和hsa-miR-655过表达组(OE组),荧光显微镜和流式细胞术(flow cytometry analysis,FCM)评估转染效率,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖能力,FCM检测细胞周期分布,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测hsa-miR-655、CLCF1、OPG和RANKL mRNA的水平,蛋白质印迹法(Western blot)检测CLCF1、OPG及RANKL蛋白的变化。结果荧光显微镜和FCM显示对照组和miR-655过表达组感染效率为80%以上;qRT-PCR结果显示,相对于对照组,过表达组MG63细胞hsa-miR-655表达上调,差异有统计学意义(P=0.0004);CLCF1 mRNA水平未见明显变化(P=0.0986);过表达组OPG(P=0.0384)、RANKL(P=0.0007)mRNA均有所上调,差异具有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,过表达组CLCF1蛋白水平表达下调(P=0.0053);与对照组比较,过表达组OPG(P=0.0021)、RANKL(P=0.0002)蛋白均上调,而OPG/RANKL比值却降低(P=0.0078),差异具有统计学意义(P<0.05);CCK-8细胞增殖实验结果显示,miR-655过表达后抑制MG63细胞增殖;FCM检测细胞周期结果显示,miR-655过表达后MG63细胞G0/G1期细胞比例增加,S期减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论hsa-miR-655通过负调控CLCF1基因的表达,抑制MG63细胞的增殖,下调OPG/RANKL的比值。

低氧对大鼠骨髓细胞OPG,RANKL和TNF-α基因表达的影响

目的:探讨低氧对大鼠骨髓细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、护骨素(OPG)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因表达的影响.方法:健康3mo龄雌性SD大鼠,处死后取其骨髓细胞进行缺氧培养,分为低氧1d组(A)、低氧3d组(B)、低氧7d组(C)、低氧14d组(D)和正常对照组(E).分别于培养后1,3,7,14d提取培养细胞总RNA,RT-PCR半定量检测各组OPG,RANKL和TNF-α基因表达变化.结果:低氧组骨髓细胞RANKL和TNF-α的mRNA表达水平与对照组比较显著升高.B,C组上述改变最为显著.OPG的mRNA表达水平与对照组比较显著降低.B,C组改变最为明显.结论:低氧可刺激大鼠骨髓细胞RANKL和TNF-α基因表达,而抑制OPG基因表达.

健骨颗粒含药血清对成骨样细胞OPG、RANKL mRNA表达的影响

目的观察健骨颗粒含药血清对OPG、RANKL mRNA表达的影响。方法制备健骨颗粒含药血清和生理盐水血清,分别干预体外培养的成骨样细胞ROS17/2.8,干预48 h后,用MTT法检测细胞增殖,荧光定量PCR检测OPG、RANKL mRNA表达。结果中药血清组对OPG mRNA表达较生理盐水血清组上升,对RANKL mRNA表达较生理盐水血清组降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论健骨颗粒含药血清能促进成骨样细胞的OPG mRNA表达并抑制其RANKL mRNA表达。

RANKL基因rs9594738位点与贵州燃煤污染型地氟病的相关性

目的:探讨核因子κB受体活化因子配体(RANKL)基因单核苷酸多态性(SNP)与贵州燃煤污染型地氟病的关系。方法:选取燃煤污染型地氟病病区样本365例为病例组,其中地氟重症组(氟斑牙明显且有氟骨症症状者)130例、地氟轻症组(有氟斑牙且无氟骨症症状者)235例,另选贵州省黔南布依族苗族自治州长顺县样本235例为对照组(无氟斑牙及氟骨症症状);采用TaqMan-MGB探针基因分型方法对上述样本RANKL基因的SNP位点rs9594738进行基因分型,分析rs9594738等位基因和基因型在各组间的分布差异。结果:rs9594738位点在地氟重症组与对照组的等位基因分布频率差异有统计学意义(P<0.05),地氟重症组男女之间基因型频率和等位基因频率差异均有统计学意义(P<0.05);遗传模式分析结果显示,在最优遗传模式显性遗传模式下,地氟重症组rs9594738基因型C/T-T/T可能是地氟重症人群的风险因素(P=0.014,OR=2.08,95%CI=1.16~3.72)。结论:RANKL基因rs9594738位点多态性与贵州省毕节市燃煤污染型地氟病氟骨症的发生可能有关联。

人成骨样细胞和前破骨样细胞ER亚型、OPG/RANKL/RANK系统、IL-6及其受体以及破骨细胞标志基因表达的研究

目的分析比较两种人成骨样细胞系(U2-OS、MG-63)和两种人前破骨样细胞系(U937、HL-60)ER亚型、OPG/RANKL/RANK系统、IL-6及其受体以及破骨细胞标志基因表达的差异,为今后研究雌激素与IL-6等细胞因子在骨组织中相互关系提供适宜的细胞模型。方法RT-PCR和免疫印迹法检测ERα、ERβ的表达,ELISA法测定IL-6的分泌,OPG、RANKL、RANK及IL-6受体的表达采用免疫印迹法进行检测,TRAP、MMP-9则采用RT-PCR技术进行分析。结果(1)转录水平及蛋白水平证实四种细胞均表达ERα和ERβ;(2)四种细胞不同程度地表达OPG和RANKL,而RANK则仅见于U937细胞表达;(3)四种细胞均表达IL-6受体(IL-6Rα、gp130),除U2-OS细胞外其余三种细胞均组成型分泌IL-6;(4)破骨细胞标志基因TRAP在两种人前破骨样细胞U937、HL-60中均表达,且表达水平相近;而MMP-9仅在U937细胞中弱表达;两种人成骨样细胞U2-OS、MG-63未见有这两种基因表达。结论筛选出用于研究雌激素与IL-6等细胞因子在骨组织中相互关系的细胞模型,同时也为今后深入阐明骨靶向和其他新型抗骨质疏松雌激素的分子机制研究奠定基础。

骨巨细胞瘤发病现状及驱动RANKL/OPG失衡机制的研究进展

骨巨细胞瘤(giant cell tumor of bone,GCTB)在我国较常见,是一种具有局部侵袭性、远处转移和恶性转化潜能的交界性肿瘤,GCTB中单核梭形基质细胞的恶性增殖和RANKL/OPG(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand/osteoprotegerin)表达失衡是其临床转归不佳的重要原因。近年来研究发现H3F3A(H3 histone family member 3A)基因突变、ZNF687(zinc finger protein 687)基因突变和端粒联合在GCTB中广泛存在,因其可通过表观遗传学调控、转录枢纽调控和染色体末端调控驱动RANKL/OPG失衡而受到关注。但目前对于GCTB发病机制的研究仍缺乏详细的总结。该文通过阐述GCTB的发病现状,对RANKL/OPG失衡的驱动因素进行详细分析并总结出关键靶点,以助于未来找到治愈骨巨细胞瘤的方法。

CGRP可以逆转由超高分子量聚乙烯引起鼠成骨细胞RANKL表达的实验研究

目的:探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对超高分子聚乙烯(UHMWPE)引起的鼠成骨细胞RANKL代谢的影响。方法:将体外培养的鼠颅骨成骨细胞在UHMWPE微粒预处理后,加入外源性不同浓度的CGRP孵育48 h,提取各组细胞m RNA、蛋白,通过实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和western blot来观察成骨细胞OPG和RANKL m RNA、蛋白表达水平的变化。结果:微粒明显刺激了RANKL的表达,降低了OPG的表达;CGRP显著抑制了鼠成骨细胞RANKL的表达。结论:CGRP抑制微粒介导的骨质溶解作用是可能是通过下调RANKL的表达实现的。

NF-κB受体激活因子配体在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性

目的在大肠杆菌中表达并纯化NF-κB受体激活因子配体(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL),并检测其生物学活性。方法 PCR扩增RANKL基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-RANKL,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析目的蛋白的表达和表达形式。表达产物经镍离子柱亲和层析、阴离子交换层析及阳离子交换层析进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度,Western blot检测其反应原性,BCA试剂盒测定蛋白浓度,并经MTT法及RAW264.7细胞分化试验测定其生物学活性。结果重组表达质粒pET-28a-RANKL经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组RANKL蛋白相对分子质量约为20 000,部分以包涵体形式存在;经纯化后纯度可达98.8%,可与相应抗体反应形成特异条带,蛋白浓度为56.72μg/ml,体外活性试验显示,RANKL具有良好的生物学活性。结论成功原核表达了RANKL,纯化的重组RANKL具有生物学活性,为骨代谢调控机制的研究及相关药物的开发提供了材料。