基于RAP1信号通路探讨右归丸延缓膝骨关节炎的软骨退变

目的通过右归丸治疗膝骨关节炎(KOA)模型大鼠,观察大鼠关节软骨形态及检测右归丸对RAP1信号通路表达和大鼠血清中的炎性因子表达,探讨右归丸对RAP1信号通路的表达及防治KOA的作用机制,为治疗提供理论基础。方法72只SPF级SD大鼠(雌雄各半)随机数字表法分为假手术组12只和造模组60只。造模组采用改良Hulth法建立膝关节OA模型,假手术组接受假手术。将造模成功的大鼠分为模型组(n=11)、右归丸低剂量组(n=12)、右归丸中剂量组(n=12)、右归丸高剂量组(n=12)及塞来昔布组(n=12)。给药阶段模型组、假手术组给予0.9%氯化钠溶液;右归丸低剂量组为等效浓度的1/2为0.5 g/d、右归丸中剂量组等效浓度为1 g/d、右归丸高剂量组为等效浓度2倍为2 g/d,塞来昔布组配置成悬浮(等效浓度为0.0072 g/d)。驱赶7周后检测并比较各组大鼠软骨病理,血清TNF-α、IL-1β和IL-18含量,以及大鼠软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun的表达水平。结果各组大鼠软骨病理检测结果显示:假手术组大鼠软骨组织未见异常,模型组大鼠关节软骨部分区域出现明显缺损,右归丸低剂量组大鼠关节软骨表面磨损较模型组有所减轻,而中、高剂量组及塞来昔布组大鼠软骨表面可见侵蚀现象明显改善。右归丸对KOA大鼠血清中的IL-1β、TNF-α、IL-18含量与模型组相比,右归丸高、中、低剂量组和塞来昔布组在大鼠血清中表达显著降低,差异具有统计学意义。与软骨组织中RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号通路活化水平检测结果显示:与假手术组比较,模型组大鼠软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun的表达水平均显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结果提示,在KOA发生时,RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号转导通路激活,介导软骨组织中炎症反应及细胞凋亡的发生,这与以往研究结果一致。右归丸干预后,软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun蛋白表达水平均显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论右归丸能够抑制KOA大鼠软骨组织中RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号通路的活化,降低炎性因子表达,从而延缓软骨退变。

Rap1 GTP酶激活蛋白对结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移作用的影响

目的探讨Rap1 GAP在结肠癌组织中的表达及与临床病理特征和预后的相关性。方法采用免疫组化EnVision两步法检测125例结肠癌组织中Rap1 GAP蛋白表达水平,应用Western blot法检测结肠癌细胞系(LOVO、HCT116、SW480)和正常结肠上皮细胞HCoEPiC中Rap1 GAP蛋白表达。通过慢病毒转染LOVO、HCT116和SW480细胞,分别下调、上调Rap1 GAP的表达,根据不同处理分为空载组(sh-NON、LV-NON)、sh-Rap1 GAP组(低表达Rap1 GAP)和LV-Rap1 GAP组(过表达Rap1 GAP),Western blot法验证细胞转染效率;采用MTT实验和Transwell实验分别检测各组细胞的增殖、侵袭和迁移能力。结果125例结肠癌标本中,Rap1 GAP缺失表达者83例(66.4%),高于癌旁对照组织(7.2%)(P<0.001)。Rap1 GAP缺失表达率与肿瘤分化程度(χ^(2)=6.152,P=0.011)、是否伴黏液腺癌(χ^(2)=4.908,P=0.028)有关,与患者性别、年龄、肿瘤发生部位、临床分期、淋巴结转移均无关(P>0.05)。Western blot结果显示,与HCoEPiC(0.189±0.081)细胞相比,LOVO(0.238±0.008)细胞中Rap1 GAP蛋白表达增高,HCT116(0.064±0.002)和SW480(0.152±0.026)细胞中Rap1 GAP蛋白表达降低(F=159.6,P<0.05)。LOVO细胞转染Rap1 GAP低表达慢病毒后,sh-Rap1 GAP-1组(0.733±0.071)、sh-Rap1 GAP-2组(0.559±0.136)和sh-Rap1 GAP-3组(0.606±0.037)Rap1 GAP蛋白表达水平明显低于LOVO组(1.880±0.129)(F=49.57,P<0.05)。与sh-NON组(1.260±0.109)相比,sh-Rap1 GAP-2组(1.569±0.059)和sh-Rap1 GAP-3组(1.548±0.087)细胞72 h增殖能力明显提高(F=28.36,P<0.05),其侵袭和迁移能力明显增高(P<0.05)。HCT116细胞转染Rap1 GAP过表达慢病毒后,与LV-NON组(0.485±0.097)相比,LV-Rap1 GAP组(1.395±0.137)Rap1 GAP蛋白表达明显较高(P<0.05)。MTT实验结果显示,与LV-NON组(0.652±0.047)相比,LV-Rap1 GAP组(1.212±0.038)细胞增殖能力降低,其侵袭和迁移能力明显降低(P<0.05)。SW480细胞的转染结果及增殖、侵袭和迁移能力与HCT116细胞一致。结论Rap1 GAP缺失表达率与结肠癌分化程度、是否伴黏液腺癌有关,上调Rap1 GAP表达能抑制结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,可为探究结肠癌的发生、发展机制提供理论依据。

小鼠上丘Rap1B表达的发育性变化及关键期单眼形觉剥夺对其的影响

目的探讨小鼠上丘Rap1B表达的发育性变化以及视觉发育关键期单眼形觉剥夺(MD)对其表达的影响。方法SPF级健康雄性C57BL/6J小鼠45只为实验对象。实验一:小鼠上丘Rap1B表达的发育性变化。该实验小鼠分为3组,即关键期前组[生后18 d(P18)小鼠]、关键期组(P32小鼠)和成年组(P60小鼠),采用qPCR和Western blot检测各组小鼠左右两侧上丘中Rap1B基因及蛋白的表达量。实验二:MD对上丘Rap1B基因及蛋白表达的影响。该实验小鼠分为2组:右眼MD组(小鼠P28时右眼建立MD模型,至P32时行检测)与NC组(正常对照组,P32小鼠),采用qPCR和Western blot检测各组小鼠左右两侧上丘中Rap1B基因及蛋白的表达。结果关键期前组小鼠左右两侧上丘中Rap1B基因和蛋白表达量均较低;与关键期前组相比,关键期组小鼠Rap1B基因及蛋白表达量均显著增高(均为P<0.05);与关键期组相比,成年组小鼠Rap1B基因和蛋白表达量均显著降低(均为P<0.05)。与NC组相比,右眼MD组小鼠左侧上丘Rap1B基因和蛋白表达量均显著增高(均为P<0.05),而右侧上丘Rap1B基因和蛋白表达量均显著降低(均为P<0.05)。结论小鼠上丘中Rap1B基因表达的发育性变化趋势与视觉发育关键期相一致,Rap1B可能参与了关键期MD对上丘发育的调控。

HPV E6通过Rap1信号通路影响宫颈癌细胞增殖、侵袭及迁移的研究

目的探讨人乳头瘤病毒E6蛋白(human papillomavirus E6 protein,HPV E6)对宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭和迁移的影响及潜在分子机制。方法基于Illumina Hiseq 4000转录组测序技术检测12例不同程度的宫颈病变组织之间的基因表达特征,筛选与HPV相关的差异基因;利用GO、KEGG Pathway方法对差异基因进行生物学功能富集分析;Western blotting检测正常宫颈上皮细胞HCerEpic、宫颈癌细胞Hela中Rap、Rap1GAP蛋白表达水平;通过平板克隆实验、Transwell实验和划痕实验检测其增殖、侵袭及迁移能力;通过sh-E6慢病毒转染下调细胞内HPV E6表达,分为对照组(Hela细胞)、空载组(sh-NON)和sh-E6组(低表达HPV E6);下调HPV E6表达,采用平板克隆和CCK-8实验分别检测每组细胞增殖能力和细胞活力;Transwell和划痕实验检测细胞侵袭、迁移能力;Western blotting检测各组细胞中E6、Rap1、Rap1GAP、CyclinD1、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达水平。在sh-E6组基础上过表达Rap1,Western blot检测细胞中Rap1通路及相关蛋白的表达水平;平板克隆实验、Transwell实验和划痕实验分别检测细胞增殖、侵袭和迁移能力。结果测序结果显示,与正常宫颈HPV阴性比较,HPV阳性的正常宫颈、CIN、宫颈癌组织中差异上调表达的基因分别有340、864和1036个;3个数据集寻找共有差异基因共24个。GO|KEGG富集分析24个差异表达基因主要富集在Rap1相关信号通路。与HCerEpic细胞相比,Hela细胞内Rap1表达升高,Rap1GAP表达降低(P<0.01);其细胞的增殖、侵袭和迁移能力增强(P<0.01);下调HPV E6表达后,与Hela组比较,sh-E6组细胞的增殖、细胞集落形成、侵袭和迁移能力降低(P<0.001);Western blotting表明,与Hela组比较,sh-E6组细胞内Rap1、CyclinD1、N-cadherin蛋白表达降低,Rap1GAP和E-cadherin蛋白表达升高(P<0.001)。与sh-E6组相比,过表达Rap1组(sh-E6/OE Rap1)细胞内Rap1/Rap1GAP、CyclinD1、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达被恢复(P<0.001),细胞增殖、侵袭迁移能力被恢复(P<0.01)。结论在宫颈癌发展过程中,HPV E6通过激活Rap1信号通路促进宫颈癌细胞增殖、侵袭及迁移。

缺氧微环境中HIP68/RAP1B信号通路对乳腺癌侵袭转移的作用

目的探讨HIP68/RAP1B信号通路对乳腺癌侵袭转移的作用机制。方法选取西安交通大学第一附属医院2012—2013年乳腺癌组织样本共73例,通过免疫组化标本及临床资料分析HIP68/RAP1B的表达情况及其与病理特征的关系。将体外培养的乳腺癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)构建成缺氧乳腺癌细胞,分别测定缺氧乳腺癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)及正常乳腺上皮细胞系SK-BR-3中HIP68/RAP1B蛋白表达情况。构建高/低表达HIP68的乳腺癌细胞,观察其对RAP1B蛋白的影响及对乳腺癌细胞生物学行为的影响;沉默/过表达乳腺癌细胞RAP1B,观察其对HIP68蛋白的影响及对细胞生物学行为的影响;免疫共沉淀检测HIP68/RAP1B的结合位点。结果HIP68和RAP1B蛋白在乳腺癌组织中的表达水平高于癌旁组织(P<0.05);HIP68表达与TNM分期、淋巴结转移相关(P<0.05),RAP1B的表达与TNM分期、淋巴结转移、ER、RR状态相关(P<0.05);HIP68表达与RAP1B表达呈正相关(r=0.427,P<0.05)。HIP68/RAP1B在缺氧乳腺癌系细胞中高表达;RAP1B蛋白的表达与HIP68表达呈正相关并且高表达HIP68/RAP1B促进细胞侵袭转移,低表达HIP68/RAP1B抑制细胞侵袭转移;HIP68蛋白不因RAP1B蛋白的高/低表达而改变,但是高表达RAP1B促进乳腺癌细胞增殖及侵袭转移;免疫共沉淀结果显示RAP1B可能为HIP 68基因的下游。结论HIP68/RAP1B信号通路在缺氧乳腺癌组织中高表达并促进乳腺癌细胞迁移和侵袭。

Rap1GAP激酶通过AMPK信号通路影响宫颈癌细胞增殖、侵袭及迁移的研究

背景肿瘤细胞快速增殖和难以控制的盆腔淋巴结转移是造成晚期宫颈癌患者死亡的主要原因。Rap1 GTP酶激活蛋白(Rap1 GTPase-activating protein,Rap1GAP)低表达与肿瘤细胞增殖、侵袭和患者不良预后相关。目的探讨Rap1GAP对宫颈癌细胞SiHa、C33a增殖、侵袭和迁移的影响及潜在的分子机制。方法从UCSC(https://xenabrowser.net)数据库中下载经统一标准化的泛癌数据集:TCGA TARGET GTEx(PANCAN,N=19131,G=60499),从中提取ENSG00000076864(Rap1GAP)基因在宫颈癌样本中的表达数据,对每一表达值进行log2(x+0.001)变换,得到Rap1GAP基因的表达;采用Western blot检测RAP1GAP在宫颈癌细胞SiHa、C33a和正常宫颈内皮细胞H8中的表达水平,通过慢病毒转染SiHa、C33a细胞分别上调/下调Rap1GAP的表达,根据不同处理分为正常对照组(SiHa、C33a细胞)、空载组(NC-Rap1GAP)、OERap1GAP组(过表达Rap1GAP)和sh-Rap1GAP组(低表达Rap1GAP),并验证细胞转染效率;采用平板克隆实验和Transwell实验分别检测细胞增殖、侵袭和迁移能力;采用Western blot及qRT-PCR检测上调/下调Rap1GAP表达后各组细胞中Rap1GAP、E-cadherin、N-cadherin蛋白及mRNA的表达;采用Western blot检测磷酸化AMPK(p-AMPK)、AMPK蛋白表达水平。结果从数据库观察到Rap1GAP在宫颈癌组织中的表达显著高于其在正常宫颈组织中的表达(P<0.05)。Western blot结果显示,与H8细胞比较,C33a细胞中Rap1GAP蛋白表达增高,SiHa细胞中Rap1GAP蛋白表达降低(P<0.05)。与SiHa组比较,OE-Rap1GAP组细胞集落形成能力、侵袭和迁移能力降低。与C33a组比较,sh-Rap1GAP组细胞集落形成能力、侵袭和迁移能力增强。Western blot及qRT-PCR实验结果表明,与SiHa组比较,OE-Rap1GAP组细胞内Rap1GAP、E-cadherin蛋白及mRNA表达升高,而N-cadherin、p-AMPK蛋白及mRNA表达降低(P<0.01);与C33a组比较,sh-Rap1GAP组细胞内Rap1GAP、E-cadherin蛋白及mRNA表达降低,而N-cadherin、p-AMPK蛋白及mRNA表达升高(P<0.01)。结论Rap1GAP抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,可能与AMPK信号通路有关。

Rap1在免疫细胞中的调节作用

小G蛋白Rap1是Ras超家族成员之一,包括Rap1a和Rap1b两种亚型。Rap1广泛存在于低等和高等动物细胞中,主要通过调控丝裂原活化蛋白激酶信号通路活性、调节整合素功能,广泛参与细胞增殖、细胞分化、细胞迁移、细胞凋亡、细胞黏附和细胞骨架重排等生物学过程。研究表明,生物体内特定组织Rap1的表达失调会导致某些自身免疫性疾病。本文就Rap1在免疫细胞中的调节作用研究进展作一综述。

cAMP/Epac/Rap1信号通路调控NG2细胞分泌IL-1β、TNF-α、BDNF及酸枣仁皂苷A的作用研究

目的研究环磷酸腺苷(cAMP)/环磷酸腺苷结合蛋白(Epac)/Ras相关蛋白1(Rap1)信号通路是否参与调控NG2细胞分泌白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、脑源性神经营养因子(BDNF)及酸枣仁皂苷A(JuA)的作用。方法体外培养NG2细胞,分为对照组、百日咳毒素(PTX)组、非环状核苷酸Epac拮抗剂(ESI-09)组、酸枣仁皂苷A(JuA)组、艾司唑仑(阳性药)组。采用CCK-8法检测不同浓度JuA对NG2细胞存活率的影响,RT-PCR法和Western blot法检测各组细胞IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1 mRNA及蛋白的表达情况。结果与对照组比较,PTX组降低IL-1β和TNF-αmRNA和蛋白的表达(P<0.01),增加BDNF和cAMP mRNA和蛋白的表达(P<0.01);ESI-09组增加IL-1β和TNF-αmRNA和蛋白的表达(P<0.05),降低BDNF、Epac和Rap1 mRNA和蛋白的表达(P<0.01);JuA组、阳性药组均增加IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论cAMP/Epac/Rap1信号通路可介导NG2细胞分泌IL-1β、TNF-α、BDNF,JuA可能作用于cAMP/Epac/Rap1信号通路影响NG2细胞分泌BDNF。

Rap1b蛋白在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨Rap1b蛋白在子宫内膜癌组织中的表达及与其临床病理参数的关系。方法选取子宫内膜癌组织标本82例(癌组织)。同时期选取子宫脱垂等手术过程中获取的正常子宫内膜组织标本45例(正常组织)。观察2组Rap1b蛋白阳性率、Rap1b蛋白表达与子宫内膜癌临床病理参数的关系、患者预后与Rap1b蛋白表达相关性。结果癌组织中Rap1b蛋白阳性率(70.73%)显著高于正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。不同病理分级、不同FIGO分期、有无淋巴结转移的子宫内膜癌患者Rap1b蛋白表达阳性率比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。经过3年随访后,82例子宫内膜癌患者中死亡8例,存活率为90.24%(74/82),其中8例死亡患者中Rap1b蛋白阳性有6例。23例复发,复发率为20.73%(17/82)。Rap1b阳性组3年累积存活率[87.93%(51/58)]低于Rap1b阴性组[95.83%(23/24)](χ^(2)=1.204,P=0.273)。结论Rap1b蛋白在子宫内膜癌组织内呈现高表达,主要与病理分级、FIGO分期、淋巴结转移存在关系,且与患者预后存在正相关,其可作为子宫内膜癌患者病情评估检测指标。

环腺苷酸激活交换蛋白1/RAS相关蛋白1信号通路在脑缺血-再灌注损伤发病机制中的研究进展

脑缺血-再灌注损伤(CIRI)是缺血性卒中患者恢复患侧脑组织血流时引发的严重并发症。CIRI患者常伴有神经功能减退、认知障碍、情绪障碍等,对日常生活产生严重影响。目前CIRI易被早期诊断,但相关特异性治疗方法相对较少。作者对环腺苷酸激活交换蛋白1/RAS相关蛋白1(Epac1/Rap1)信号通路与CIRI的相关性研究进行综述,以期为CIRI患者的临床治疗提供新思路。

C3G/Rap1和Dock180/Rac1信号通路在卵巢癌浸润中的作用

目的探讨鸟嘌呤核苷酸交换因子C3G/Rap1酶和鸟嘌呤核苷酸交换因子Dock180/Rac1酶信号通路在卵巢癌浸润中的可能作用。方法 Western blot检测Dock180沉默的卵巢癌细胞SKOV3中C3G的表达,验证上皮性卵巢癌组织中Dock180与C3G的表达相关性;免疫组化比较卵巢癌组织中Dock180与C3G的表达趋势;免疫荧光观察SKOV3中Dock180与C3G及它们各自的下游蛋白Rac1/Rap1的定位。结果 Dock180基因沉默的细胞中C3G表达明显增强(P<0.05);Dock180与C3G在卵巢癌组织中的表达呈现相反趋势(P<0.05);C3G/Dock180均主要分布于细胞质,下游效应蛋白Rap1/Rac1在细胞膜和细胞质都有表达,但Rap1以细胞质为主,而Rac1可以伸展至细胞膜及细胞膜皱褶。结论卵巢癌细胞和组织中C3G与Dock180表达呈相反趋势,下游蛋白Rap1与Rac1在细胞内的定位分布差异,可能与C3G/Rap1和Dock180/Rac1信号通路在卵巢肿瘤浸润中的不同作用有关。

Rap1a高表达对SNL大鼠神经病理性疼痛及星形胶质细胞自噬的影响

目的分析L5脊神经结扎(SNL)大鼠脊髓组织中Rap1a的表达及其对神经病理性疼痛的影响,探讨其作用机制。方法采用L5脊神经结扎法制备SNL大鼠模型,分为假手术(n=6)、SNL模型组(n=30)、生理盐水组(n=6)、Cont-shR组(n=6)、Rap1a-shR组(n=6)、雷帕霉素组(n=6),经由鞘内注射法处理后,采用Von-Frey纤维丝法检测大鼠机械痛阈值,采用RT-PCR和Western blot法检测大鼠脊髓组织和星形胶质细胞中Rap1a的表达、mTOR活性及自噬水平。结果 SNL大鼠脊髓组织中Rap1a的表达水平较生理盐水组显著上升,机械痛阈明显降低(P<0.05)。Rap1a shRNA腺病毒感染后,SNL大鼠机械痛阈明显升高(P<0.05),大鼠脊髓组织及分离培养的星形胶质细胞中细胞自噬标志分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值升高,p62表达水平下降,细胞自噬水平增加,且mTOR活化水平降低(P<0.05)。细胞自噬诱导剂雷帕霉素作用后,星形胶质细胞及SNL大鼠脊髓组织细胞自噬水平均明显增加,SNL大鼠的机械痛阈显著升高(P<0.05)。结论神经损伤引起的Rap1a高表达对神经病理性疼痛的发展有促进作用,这一过程可能与Rap1a对mTOR信号通路及星形胶质细胞自噬水平的调节有关。

宫颈癌组织中Rap1GAP蛋白表达及其与HPV感染的相关性

[目的]探讨Rap1GAP蛋白在宫颈癌组织中的表达变化以及其与HPV感染之间的关系。[方法]免疫组化方法检测20例宫颈癌与20例正常宫颈组织HPV感染和Rap1GAP蛋白表达情况。[结果]HPV检出阳性率在正常宫颈组织和宫颈癌中分别为20%与75%,宫颈癌组明显高于正常宫颈组(P<0.05)。宫颈癌组的Rap1GAP蛋白表达阳性率为15%、弱阳性率为15%,二者均明显低于正常宫颈组(阳性率,55%和弱阳性率,45%)(P均<0.05)。宫颈癌组织中,HPV阳性组Rap1GAP蛋白缺失率为80%,明显高于HPV阴性组的缺失率40%(P<0.05),且二者之间呈正相关(r=0.553,P<0.05)。[结论]宫颈癌组织Rap1GAP蛋白表达下调或缺失可能与HPV感染有关。

获得性再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞TRF1、TRF2、RAP1 mRNA表达研究

本研究检测获得性再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞的TRF1、TRF2、RAP1基因表达水平,探讨其与获得性再生障碍性贫血发病的关系。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测40例获得性再生障碍性贫血患者和20例正常对照组外周血单个核细胞中TRF1、TRF2、RAP1的基因表达情况。结果表明,获得性再生障碍性贫血患者的TRF1和RAP1 mRNA表达水平较正常对照组明显升高(P<0.05);TRF2 mRNA表达水平较正常对照组明显降低(P<0.01),并且TRF2与RAP1具有相关性(r=0.522,P=0.001)。结论:TRF1、TRF2、RAP1可能参与了获得性再生障碍性贫血的发病过程。

胃癌组织Rap1GAP、HHLA2表达变化及其与患者临床病理特征和预后的关系

目的观察胃癌组织Rap1 GTP酶激活蛋白(Rap1GAP)、人内源性逆转录病毒-H长末端重复关联蛋白2(HHLA2)mRNA表达变化,并探讨其表达与患者临床病理特征和预后的关系。方法选择胃癌患者97例,取手术切除的胃癌组织及其配对的癌旁正常组织,采用RT-qPCR法检测Rap1GAP、HHLA2 mRNA表达。比较胃癌组织与癌旁正常组织Rap1GAP、HHLA2 mRNA表达差异,分析二者表达与胃癌患者临床病理特征的关系。以Rap1GAP、HHLA2 mRNA表达的中位数为截断值,将患者分为Rap1GAP、HHLA2 mRNA高表达者与低表达者,比较不同Rap1GAP、HHLA2 mRNA表达者5年生存率差异。采用Cox风险比例回归模型分析影响胃癌患者预后的危险因素。结果胃癌组织Rap1GAP mRNA相对表达量低于癌旁正常组织,HHLA2 mRNA相对表达量高于癌旁正常组织(P均<0.05)。Rap1GAP、HHLA2A mRNA表达与肿瘤浸润深度、TNM分期和淋巴结转移有关(P均<0.05),与性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度无关(P均>0.05)。Rap1GAP mRNA低表达者5年生存率低于Rap1GAP mRNA高表达者,HHLA2 mRNA高表达者5年生存率低于HHLA2 mRNA低表达者(P均<0.05)。Cox风险比例回归分析显示,有淋巴结转移、Rap1GAP mRNA低表达、HHLA2 mRNA高表达是胃癌患者预后不良的危险因素(P均<0.05)。结论胃癌组织Rap1GAP低表达、HHLA2高表达,二者异常表达与胃癌恶性生物学行为和患者预后不良有关。Rap1GAP、HHLA2有可能成为胃癌预后评估的生物标志物和潜在的治疗靶点。

胞质Rap1与胞核NF-κB p65在胃癌组织中的表达及相关性

目的探讨胞浆Rap1和胞核NF-κB p65在胃癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法采用免疫组织化学的方法检测92例胃癌及癌旁正常组织Rap1和NF-κB p65的表达。结果胃癌组织胞质Rap1平均染色评分为6.53±0.38,明显高于癌旁正常组织(1.70±0.10,P<0.001)。Rap1胞质表达水平与胃癌的分化程度、TNM分期及淋巴结转移相关(P<0.05),与年龄、性别无关;胃癌组织胞核NF-κB p65表达明显高于癌旁正常组织(7.12±0.42 vs 1.74±0.05,P<0.001)。胞质Rap1和胞核NF-κB p65在胃癌组织中的表达呈显著正相关(Kendall'stau-b=0.447,P<0.001)。结论胃癌组织Rap1胞质表达可能与NF-κB介导的信号转导通路相关,共同参与胃癌的发生发展。

Rap1GAP1在人胰腺癌组织中的表达及意义

目的通过检测Rap1GAP1在人胰腺癌中的表达情况及rap1GAP1在三种人胰腺癌细胞系中的突变情况,探讨其在人胰腺癌发生发展过程中的作用。方法 (1)采用免疫组织化学Envision两步法,检测73例人胰腺癌组织及其癌旁胰腺组织中Rap1GAP1的表达情况,并分析其与胰腺癌临床病理特征之间的关系;(2)采用RT-PCR和测序法检测三种人胰腺癌细胞系中rap1GAP1的突变情况。结果(1)Rap1GAP1在癌旁胰腺组织、胰腺上皮内肿瘤(pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN)1a、1b、2及3级和浸润性胰腺癌中的阳性率分别为100%、93.8%、92.3%、70.0%、57.9%和13.7%。癌旁胰腺组织、各级PanIN与浸润性癌之间的表达差异有统计学意义(P<0.01);Rap1GAP1在高、中和低分化胰腺癌中阳性率分别为26.9%、7.1%和0,显示Rap1GAP1的表达与胰腺癌的分化程度有关(P<0.05)。而Rap1GAP1的表达与患者的年龄、性别、淋巴结转移情况和临床分期无关。(2)Panc-1、MiaPaCa-2细胞系中存在rap1GAP1关键区域(催化结构域)的大片段缺失,而Aspc-1细胞系含有完整的编码rap1GAP催化结构域的外显子。结论相比于癌旁胰腺组织和各级PanIN,浸润性胰腺癌中Rap1GAP1的表达显著降低。另外,Rap1GAP1在低分化胰腺癌中的表达显著降低。提示Rap1GAP1可能是胰腺癌发生发展过程中的一个晚期事件。三种人胰腺癌细胞系中的突变分析结果提示其表达降低可能与遗传学上的大片段缺失有关。

Rap1GAP二聚体的形成对其在细胞内定位的影响

目的观察Rap1GAP二聚体的形成对其在细胞内定位的影响。方法对绿色荧光蛋白标记的Rap1GAP野生体编码第90和99位氨基酸的核苷酸进行定点突变,制备绿色荧光蛋白标记的Rap1GAP二聚体缺失突变体M90和M99。将Rap1GAP野生体及二聚体缺失突变体单独或者分别与活化型Gα共转染HEK293细胞,在荧光显微镜下观察野生体和二聚体缺失突变体在细胞内的分布情况。结果野生型Rap1GAP与二聚体缺失突变体Rap1GAP分别单独转染HEK293细胞时,野生型和突变体Rap1GAP均弥漫分布胞质内;当野生型与突变体Rap1GAP分别与活化型Gα共转染HEK293细胞时,野生型和突变体Rap1GAP均主要分布在细胞膜上。结论Rap1GAP二聚体的形成对其在细胞内的定位没有影响。

miR-488-3p靶向调控RAP1A在同型半胱氨酸介导肝细胞自噬的作用研究

目的探讨微小RNA(miR-488-3p)通过靶向调控RAS癌基因家族成员RAP1A在同型半胱氨酸介导肝细胞自噬中的作用。方法体外常规培养人正常肝细胞(HL-7702),并给予100μmol/L Hcy干预24 h,采用Western blot检测肝细胞自噬相关蛋白LC3、p62和RAP1A的表达水平,qRT-PCR检测肝细胞中miR-488-3p和RAP1A的表达;转染miR-488-3p inhibitor和mimics后,qRT-PCR和Western blot分别检测miR-488-3p的转染效率及其对LC3和p62蛋白表达的影响;TargetScan预测miR-488-3p与RAP1A基因相关性,Western blot检测miR-488-3p下游潜在靶蛋白(RAP1A)的表达改变;Pearson相关系数对肝细胞中miR-488-3p表达水平与自噬相关蛋白水平进行相关性分析。结果与Control组相比,Hcy组肝细胞自噬相关蛋白LC3、RAP1A和miR-488-3p的表达水平升高(P<0.01),而p62表达明显降低(P<0.01);同时,转染miR-488-3p inhibitor和mimics后,与NC-inhibitor组比较,miR-488-3p inhibitor组中LC3和RAP1A蛋白的表达水平显著降低(P<0.01),p62表达明显升高(P<0.01);而与NC-mimics组相比,miR-488-3p mimics组中LC3和RAP1A蛋白表达水平明显增加(P<0.01),p62表达降低(P<0.01);进一步机制研究表明RAP1A是miR-488-3p的下游靶基因并受其正向调控。Pearson相关性分析发现,miR-488-3p的表达水平与LC3(r=0.9329,P=0.0002)蛋白表达呈正相关,而与p62(r=-0.8086,P=0.0083)表达则呈负相关。结论miR-488-3p在Hcy介导的肝细胞中高表达,可通过靶向调控RAP1A的表达促进肝细胞自噬。

靶向Rap1b基因shRNA慢病毒载体的构建及其对食管鳞癌细胞Rap1b基因表达的沉默

目的:设计以Rap1b基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染食管鳞癌细胞,观察其在食管鳞癌细胞中的表达。方法:应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体pGLV3-GFP中,构建pGLV3-GFP-Rap1b-shRNA1/2/3/4。并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染食管鳞癌细胞株Eca109后Rap1b基因的表达情况。结果:测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109TU/ml,pGLV3-GFP-Rap1b-shRNA3/4转染后72h和96h均可显著抑制Rap1b基因mRNA及蛋白的表达。结论:成功构建Rap1b基因的shRNA慢病毒载体,所介导的RNAi能有效抑制食管鳞癌细胞Eca109中Rap1b基因的表达。