基于RAP1信号通路探讨右归丸延缓膝骨关节炎的软骨退变

目的通过右归丸治疗膝骨关节炎(KOA)模型大鼠,观察大鼠关节软骨形态及检测右归丸对RAP1信号通路表达和大鼠血清中的炎性因子表达,探讨右归丸对RAP1信号通路的表达及防治KOA的作用机制,为治疗提供理论基础。方法72只SPF级SD大鼠(雌雄各半)随机数字表法分为假手术组12只和造模组60只。造模组采用改良Hulth法建立膝关节OA模型,假手术组接受假手术。将造模成功的大鼠分为模型组(n=11)、右归丸低剂量组(n=12)、右归丸中剂量组(n=12)、右归丸高剂量组(n=12)及塞来昔布组(n=12)。给药阶段模型组、假手术组给予0.9%氯化钠溶液;右归丸低剂量组为等效浓度的1/2为0.5 g/d、右归丸中剂量组等效浓度为1 g/d、右归丸高剂量组为等效浓度2倍为2 g/d,塞来昔布组配置成悬浮(等效浓度为0.0072 g/d)。驱赶7周后检测并比较各组大鼠软骨病理,血清TNF-α、IL-1β和IL-18含量,以及大鼠软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun的表达水平。结果各组大鼠软骨病理检测结果显示:假手术组大鼠软骨组织未见异常,模型组大鼠关节软骨部分区域出现明显缺损,右归丸低剂量组大鼠关节软骨表面磨损较模型组有所减轻,而中、高剂量组及塞来昔布组大鼠软骨表面可见侵蚀现象明显改善。右归丸对KOA大鼠血清中的IL-1β、TNF-α、IL-18含量与模型组相比,右归丸高、中、低剂量组和塞来昔布组在大鼠血清中表达显著降低,差异具有统计学意义。与软骨组织中RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号通路活化水平检测结果显示:与假手术组比较,模型组大鼠软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun的表达水平均显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结果提示,在KOA发生时,RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号转导通路激活,介导软骨组织中炎症反应及细胞凋亡的发生,这与以往研究结果一致。右归丸干预后,软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun蛋白表达水平均显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论右归丸能够抑制KOA大鼠软骨组织中RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号通路的活化,降低炎性因子表达,从而延缓软骨退变。

老年非创伤性股骨头坏死组织中Rap1-PI3K/Akt信号通路表达特点及作用

目的探讨老年非创伤性股骨头坏死组织中Ras相关蛋白(Rap)1-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路表达特点及作用。方法老年非创伤性股骨头坏死患者50例为非创伤性股骨头坏死组,同期老年创伤性股骨头坏死患者50例为创伤性股骨头坏死组。非创伤性股骨头坏死组取两个区域(坏死区、正常区)骨组织样本,创伤性股骨头坏死组取正常区域骨组织标本,进行苏木精-伊红(HE)和免疫组化染色,实时荧光定量PCR、Western印迹检测Rap1、血管内皮生长因子(VEGF)、PI3K、Akt mRNA和蛋白表达水平。结果HE染色显示,非创伤性股骨头坏死区域软骨细胞数量明显减少,软骨下骨小梁增厚、断裂,细胞核消失,出现软骨陷窝,周围新生毛细血管和纤维母细胞等肉芽组织长入坏死组织,出现肉芽组织增生。免疫组化染色显示,非创伤性股骨头坏死组组织坏死区域Rap1、VEGF、PI3K、Akt表达强度(■)弱于非创伤性股骨头坏死组组织正常区域(■)、创伤性股骨头坏死组组织正常区域(■)。非创伤性股骨头坏死组骨组织坏死区的Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA和蛋白表达水平明显低于非创伤性股骨头坏死组骨组织正常区、创伤性股骨头坏死组骨组织正常区(P<0.05);两组骨组织正常区Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论Rap1-PI3K/Akt信号通路激活受限造成血管内皮损伤,进而导致老年非创伤性股骨头坏死。

白花蛇舌草通过抑制RAP1-JNK信号通路选择性促进人肾癌ACHN细胞间质-上皮转化

目的 :研究白花蛇舌草(Hedyotis di usa Willd,HDW)对人肾癌细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移和侵袭的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 :人肾细胞腺癌ACHN和人肾近曲小管HK-2细胞经HDW处理24 h后,采用CCK-8法检测HDW对ACHN和HK-2细胞增殖的影响,FCM法检测HDW对细胞周期和凋亡的影响。光学显微镜下及罗丹明染色法观察HDW处理对ACHN和HK-2细胞形态的影响;采用免疫荧光染色法和蛋白质印迹法检测间质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET)相关蛋白表达的变化。划痕愈合实验和Transwell小室法检测ACHN和HK-2细胞的迁移和侵袭能力,RNA测序法检测HDW对ACHN细胞转录组的影响;实时荧光定量PCR法检测RAP1信号通路相关基因RAP1GAP、RASGRP2、RAPGEF3、MAGI1及GNAI1 mRNA的表达水平;蛋白质印迹法检测丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activate protein kinase,MAPK)通路相关蛋白c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phospho-JNK,p-JNK)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)、磷酸化Akt(phospho-Akt,p-Akt)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和磷酸化ERK(phospho-ERK,p-ERK)表达水平的改变。结果:HDW可选择性抑制ACHN细胞增殖(P <0.01),将细胞周期阻滞于S期(P <0.01),诱导细胞凋亡(P <0.01)。HDW处理后ACHN细胞的形态发生了明显变化,HDW可促进ACHN细胞中E-钙黏蛋白1(E-cadherin 1)和β-连环蛋白(β-catenin)的表达,并抑制波形蛋白(Vimentin)和Snail1的表达(P值均<0.01)。HDW能显著抑制细胞的迁移和侵袭能力(P值均<0.01),且ACHN和HK-2细胞之间没有明显差异。RNA测序结果分析显示,HDW可影响细胞周期相关基因以及控制细胞生长的转录因子E2F和Myc靶基因的表达,并激活p53信号通路;HDW可显著下调ACHN细胞中RAP1GAP、RASGRP2、RAPGEF3、MAGI1及GNAI1 mRNA(P值均<0.000 1)和p-JNK蛋白的表达水平。结论 :HDW可能通过抑制RAP1-JNK信号通路来选择性抑制肾癌细胞ACHN的增殖,促进ACHN细胞MET、周期阻滞和凋亡。

基于小RNA测序和数据库比对探究PRMT1调控的sncRNAs在哮喘中的作用

小非编码RNA(small non-coding RNA,sncRNA)包括microRNA(miRNA)和PIWI蛋白互作RNA(PIWI-interacting RNA,piRNAs),其异常表达参与支气管哮喘(简称哮喘)气道上皮炎症过程。目前的研究多基于哮喘相关sncRNA的异常表达功能研究,少有对sncRNA表达变化原因的探究。我们前期的研究发现,蛋白质精氨酸甲基转移酶1(protein arginine methyltransferase 1,PRMT1)作为哮喘标志性分子,参与上皮细胞炎症的发生和气道下重塑。本文利用过表达人肺上皮细胞BEAS-2B中哮喘标志性基因PRMT1,进行sncRNA深度测序并与哮喘数据库联合分析,将差异表达的sncRNA与5个Gene Expression Omnibus(GEO)测序数据集进行比较,发现23种PRMT1调控的哮喘相关的sncRNA。利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证,筛选出12种miRNA和2种piRNA。将这些sncRNA靶基因与哮喘病人生成的上皮细胞样本mRNA测序结果(GSE18965和GSE43696)进行交叉比对,初步确定哮喘相关基因,并进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)预测。分析表明,哮喘相关sncRNA主要靶标是Ras/Rap1-MAPK信号通路,包含53种靶基因。本研究通过小RNA测序(small RNA Seq)技术探寻PRMT1调控的下游sncRNA,比对现有的数据库,识别出PRMT1调节的sncRNA及其目标信号通路Ras/Rap1-MAPK,为哮喘的发病机制研究提供了新的sncRNA分子和信号通路靶点。

右美托咪定预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其机制

目的观察右美托咪定(Dex)预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的影响,并探讨其机制是否与氧化应激及Epac1/Rap1信号通路有关。方法SD大鼠随机分为假手术组、模型组、Dex组、抑制剂组各8只。Dex组在建模前30 min腹腔注射Dex,抑制剂组在建模前30 min及25 min时分别腹腔注射Epac1拮抗剂ESI09及Dex,假手术组、模型组在建模前30 min腹腔注射相同剂量的生理盐水。除假手术组外,各组均通过结扎左冠状动脉建立MIRI模型,假手术组心脏仅穿线而不结扎左冠状动脉。采用苏木精—伊红(HE)染色观察各组心肌组织病理学变化,ELISA法检测大鼠血清心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)及氧化应激指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD),Western blotting法检测大鼠心肌组织Epac1/Rap1信号通路相关蛋白Epac1、Rap1。结果假手术组心肌纤维排列整齐、边缘清晰,未见心肌纤维断裂和细胞间质肿胀;模型组心肌纤维出现断裂,排列紊乱、边界模糊,有明显中性粒细胞浸润,细胞间质肿胀明显;Dex组与抑制剂组心肌纤维断裂、中性粒细胞浸润减少、间质肿胀均减轻。血清CK-MB、LDH模型组>Dex组>抑制剂组>假手术组;血清MDA模型组>Dex组>抑制剂组>假手术组,血清SOD假手术组>抑制剂组>Dex组>模型组;心肌组织Epac1、Rap1蛋白表达模型组>Dex组>抑制剂组>假手术组(P均<0.05)。结论Dex预处理对大鼠MIRI具有抑制作用,其机制可能与激活Epac1/Rap1信号通路减轻心肌组织氧化应激有关。

白三烯B4在“肺保护性”通气致肺损伤中的作用机制

目的探讨白三烯B4(LTB4)在“肺保护性”机械通气(LPMV)致肺损伤中的作用机制。方法32只健康日本大耳白兔随机平均分为:溶剂预处理+假手术组(S组)、乌苯美司(白三烯A4水解酶抑制剂)预处理+假手术组(BS组)、溶剂预处理+LPMV组(PM组)和乌苯美司预处理+LPMV组(BPM组)。BS组和BPM组先实施连续5 d的乌苯美司8 mg/(kg·d)灌胃预处理,S组和PM组则在相同时间点灌胃给予同等容积的溶剂。乌苯美司或溶剂预处理结束后,对PM组和BPM组实验动物实施时长为5 h的LPMV:潮气量(VT)=8 mL/kg,呼气末正压(PEEP)=5 cm H2O,吸气时间:呼气时间(I∶E)=1∶2,吸入氧浓度(FiO2)=0.5,调整呼吸频率(RR)维持呼末CO2在35~45 mmHg范围内;S组和BS组则保留自主呼吸。酶联免疫法用于检测实验动物肺组织LTB4和环一磷酸腺苷(cAMP)含量;肺组织cAMP含量、蛋白激酶A(PKA)蛋白表达水平和活化Rap1蛋白(Rap1-GTP)/总Rap1蛋白比值分别用于反映cAMP/PKA和Rap1信号通路活性变化情况;用肺通透性[肺通透性指数和肺湿/干(W/D)重比值]、肺炎症反应[支气管肺泡灌洗液(BALF)中多形核白细胞(PMN)计数和肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性]和肺组织形态学评分对肺损伤的严重程度进行判断。结果S组与BS组实验动物各检测指标无显著差异;除肺组织学评分无显著差异外,PM组和BPM组实验动物其余各指标均显著增高于S组(P<0.05);与PM组相比,BPM组实验动物肺内LTB4生成明显减少(P<0.05),cAMP/PKA和Rap1信号通路活性进一步上调(P<0.05),肺炎症反应与肺通透性增加明显减轻(P<0.05)。结论LPMV会造成实验动物肺内LTB4大量生成继而诱发肺炎症反应和肺通透性增加,LTB4在其中的作用机制与下调cAMP/PKA和Rap1信号通路活性有关;乌苯美司可通过抑制肺内LTB4的生成发挥抗LPMV诱导的肺炎症反应和肺通透性增加保护作用。