RAPD-PCR系统优化用于对水稻穗型性状的分析

本实验优化了RAPD-PCR体系,并用于对重组自交系F_(12)群体中随机挑选直穗水稻和弯穗材料进行分析。结果表明,优化的RAPD-PCR体系可用于多态性分析,从100条随机引物中筛选到7条对模板DNA扩增出了具有重复性较好、清晰、稳定、多态性高的谱带,优化后的RAPD-PCR系统可望应用于对直穗和弯穗这一对性状的分析。

双孢蘑菇RAPD-PCR反应体系的优化

本研究对6个影响双孢蘑菇RAPD-PCR反应的关键因素进行了一系列优化,目的在于建立理想的RAPD最佳反应条件和反应体系,为大量双孢蘑菇品种间的RAPD多样性分析做准备。各关键因素梯度设置如下:(1)7个退火温度梯度:33.5、36.5、38.3、40.1、43.7、45.4、48.1℃。(2)6个Mg2+浓度梯度:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3mmol/L。(3)5个Taq酶用量梯度:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5U。(4)5个dNTPs浓度梯度:0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mmol/L。(5)5个引物浓度梯度:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μmol/L。(6)7个模板DNA用量梯度:100、20、4、0.8、0.16、0.032、0ng。实验结果表明:最佳的RAPD反应体系为:10×buffer2.0μl、Taq酶1.5U、模板DNA4-100ng、MgCl22.0mmol/L、dNTP0.20mmol/L,引物0.3μmol/L,加ddH2O至20μl。PCR热循环参数为94℃预变性5min;94℃变性1min,44℃退火1min50s,72℃延伸2min,循环40次;最后72℃延伸7min。

星星草RAPD-PCR反应体系建立与优化

目的:寻找一个可用于星星草(Puccinellia tenuiflora(Griseb.)Scribn.et Merr)RAPD-PCR的最适宜的反应体系。方法:利用正交设计法对影响PCR扩增效果的一些因素诸如TaqDNA聚合酶的用量、Mg2+浓度、dNTP以及引物浓度等指标进行筛选和优化。然后,通过引物对该优化结果进行验证。结果:正交设计结果表明,最适宜的PCR反应条件:20μl PCR反应体系中包括10×buffer2μl、模板DNA20ng、dNTP1.6mmol/L、TaqDNA聚合酶0.35U、引物1.0mmol/L、Mg2+1.8mmol/L。验证结果表明,该体系扩增出的条带多且清晰。结论:该研究得出的体系是适合RAPD-PCR的最适宜的反应体系,为今后星星草遗传多样性的研究奠定了基础。

松材线虫RAPD-PCR反应体系的优化与分子鉴定标记的筛选

应用随机引物S344、S356和S360比较分析了PCR热循环复性温度、Mg^2＋浓度和模板浓度对松材线虫基因组DNA的RAPD扩增结果的影响，旨在建立松材线虫的最佳反应体系，并以此进行松材线虫的分子鉴定标记筛选。结果表明：37℃的复性温度、3．0mmol·L^-1Mg^2＋、10μL反应体系中松材线虫基因组DNA模板1～25ng是研究松材线虫RAPD特征的最佳反应体系。利用此反应体系，通过对100个随机引物的分析，获得了3条松材线虫区别于拟松材线虫的分子鉴定标记。

平菇RAPD-PCR反应体系优化研究

以平菇黑丰268为试材，对RAPD—PCR反应体系的各项影响因素进行了优化，建立了平菇RAPD—PCR反应体系。结果表明，平菇RAPD—PCR最优体系为：20μl PCR反应体系中，Mg^2＋浓度为1．4mmol／L，模板DNA为50ng，引物浓度为0．6—0．8μmol／L，dNTPs浓度为250μmol／L，Taq酶为1．2U，10×Buffer2．0μl。

咖啡ISSR与RAPD-PCR反应体系优化

以中粒种咖啡部分种质为试材,采用U25(55)均匀设计表,对影响ISSR和RAPD标记的模板DNA、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶和引物浓度5个因素进行优化,分别建立适合于中粒种咖啡ISSR-PCR和RAPD-PCR标记的反应体系。结果表明:2种标记的反应体系相似,20μL的反应体系中含DNA模板20 ng,Mg2+1.5 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,Taq酶1.25 U,引物0.6μmol/L。利用所确立的体系对13份中粒种咖啡种质进行扩增,结果条带清晰明亮,多态性好。

杨梅RAPD-PCR体系的正交优化研究

以杨梅DNA为模板,对影响杨梅RAPD-PCR扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立杨梅RAPD反应的最佳体系。通过采用正交试验设计的方法,对杨梅RAPD-PCR条件进行了优化,结果表明最佳的杨梅RAPD-PCR的反应体系(20μl)中含有1×buffer,1.0U TaqDNA聚合酶,3.0mmol/L MgCl2,0.30mmol/L dNTPs,1.5μmol/L引物和模板DNA 30-40ng。适宜的扩增条件为94℃预变性3min,再进入38个PCR循环(94℃变性30s,38℃退火30s,72℃延伸90s),72℃延伸7min,4℃保存。

萝卜基因组DNA RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

对影响PCR反应的主要因子——模板DNA、引物、dNTPs和Mg^2＋浓度进行优化，建立起适合于萝卜基因组DNA的RAID和IssR反应体系。RAPD反应体系（18μl）为随机引物0．4～0．6μmol／L，dNTPs0．15～0．2mmol／L，Mg^2＋ 2．0mmol／L，模板DNA10～40ng，TaqDNA聚合酶0．8U；ISSR反应体系（16-）为引物0．5μmol／L，dNTPs 0．16mmol／L，Mg^2＋ 2．5mmol／L，模板DNA10～40ng，TaqDNA聚合酶0．64U。对扩增程序中复性温度进行了梯度PCR试验，表明35～42℃（37℃）与52．4-58．3℃（55℃）分别适于萝卜基因组DNA的RAID．PCR和ISSR-PCR反应：应用优化的RAPD和ISSR反应体系对17个萝卜品种进行了鉴定分析。研究结果将为萝卜分子育种、品种鉴定与种子纯度检测提供重要的技术基础。

黄皮RAPD-PCR反应体系的优化

以5′-GTCGTTCCTG-3′为随机引物,以酸黄皮为试材,对黄皮RAPD反应体系进行了优化研究,结果表明:20μL反应体系中,Taq DNA聚合酶、Mg2+、随机引物、模板DNA和dNTPs 5种主要成分的适宜浓度和用量分别为2.0 U、2.5 mmol/L、0.5 umol/L、50 ng、0.20 mmol/L。适宜的扩增程序为94℃预变性3 min,1个循环;94℃变性45 s,36℃退火45 s,72℃延伸1 min,38个循环;72℃后延伸7 min。

甘薯RAPD-PCR反应条件的优化

以徐薯22的基因组DNA作为PCR反应模板,以随机引物进行RAPD-PCR反应,通过设置TaqDNA聚合酶加量、MgCl2浓度、dNTPs浓度、模板DNA加量、引物加量的不同梯度,探索出一套适合甘薯RAPD-PCR的最优反应条件。试验结果表明,最优反应条件为反应体系25.0μL,2.5μL的PCR 10×Buffer、0.15U的Taq DNA聚合酶、3.0 nmol·μL-1的MgCl2、0.6 nmol·μL-1的dNTPs、40 ng的DNA模板、40 ng的RAPD引物。

西瓜RAPD-PCR体系的正交优化研究

采用正交试验设计的方法,建立了西瓜RAPD分析的优化反应体系,即20μL反应体系中含有1×buffer,dNTP 250μmol/L、Primer0.4μmol/L、MgCl2 2.0mmol/L、Taq酶1 U和模板DNA 20～40ng.适宜的扩增条件为94℃5 min;94℃30 s,37℃45 s,72℃90 s,45个循环;72℃5 min;4℃保存.

11种兰属植物DNA的提取及RAPD-PCR实验体系的建立与优化

采用改进的CTAB-DNA提取方法，从11种兰属植物的嫩叶中提取总DNA。所得的DNA样品的A260／A280值在1．7～1．9之间，琼脂糖凝胶上主带清晰，较少降解，样品纯度高，DNA量大。另外，对影响RAPD-PCR的Mg^2＋、dNTPs、Taq酶、引物浓度等因素进行了优化。确定优化的反应体系为：75ng模板DNA，1×Buffer，2．5mmol／LMg^2＋，0．15mmol／LdNTPs，0．75UTaq酶，引物浓度0．4μmol／L，反应总体积为25山。该体系在20个供试兰属实验材料中获得较好的扩增结果。

利用单因子和正交设计双重实验法优化鹧鸪茶RAPD-PCR反应体系

为了建立鹧鸪茶RAPD-PCR的优化反应体系,首先通过单因素试验选定其各影响因子比较适宜的浓度范围,再利用正交试验设计方法,对影响鹧鸪茶RAPD-PCR反应的5种因素进行4水平优化试验。并运用SAS软件对试验结果进行了分析,最后确定优化的RAPD-PCR反应体系为:10×Buffer缓冲液2.5μL+Mg2+2.5mmol/L+dNTPs0.2mmol/L+TaqDNA聚合酶1.5U+S28引物0.48mmol/L+80ng模板,定容至25μL。PCR扩增程序为:94℃预变性4min,然后按94℃变性30s,38℃退火45s,72℃延伸120s,进行45个循环,最后72℃延伸10min;16℃保存。该优化的RAPD-PCR反应体系具有良好的稳定性和重现性,可应用于鹧鸪茶不同居群间亲缘关系和遗传多样性分析。

海南龙血树RAPD-PCR反应体系的优化

采用单因子试验和正交试验设计,对影响海南龙血树RAPD-PCR反应的模板DNA量、Mg2+、dNTP和引物浓度,Taq聚合酶用量等因子进行研究,分析各因子对RAPD-PCR扩增结果的影响,确立了海南龙血树RAPD-PCR反应的最佳条件,即在25μL反应体系中,包含10×buffer2.5μL,2.0mmol/L MgCl2,300μmol/L dNTPs,Taq酶1.5U,引物0.8μmol/L和DNA模板20ng。以此条件为基础,筛选出适用于海南龙血树RAPD-PCR分析的18条有效引物,为采用RAPD技术分析海南龙血树种群遗传变异水平和遗传结构打下了基础。

利用正交设计优化兴安落叶松RAPD-PCR反应体系

以兴安落叶松针叶DNA为模板,对影响落叶松RAPD-PCR扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立兴安落叶松RAPD-PCR反应的最佳体系。通过采用正交设计L16(45)对兴安落叶松RAPD-PCR反应的5因素(Taq酶、Mg2+、dNTP、模板DNA、引物)在4个水平上进行优化试验,结果表明兴安落叶松最佳的RAPD-PCR的反应体系(20μL)中含有模板90ng,0.5μmol·L-1的引物,1×反应缓冲液,DNTP各为0.25mmol·L-1,1U的TaqDNA聚合酶,Mg2+2.5mmol·L-1。在此基础上筛选出20个扩增稳定、多态性丰富的RAPD引物,并通过梯度PCR试验,确定了引物最佳退火温度。

人参基因组DNA的提取及RAPD-PCR反应条件的优化

探讨了人参基因组DNA提取方法及RAPD-PCR反应条件的优化.结果表明,用改良的CTAB方法提取的DNA均达到了RAPD-PCR分析的要求;优化的RAPD-PCR反应条件为:在25μL RAPD-PCR反应体系中,模板DNA 20 ng,dNTP 200μmol/L,MgCl21.5mmol/L,10×Buffer 2.5μL,引物浓度0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,其余以ddH2O定容至25μL.PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃45 s,40℃退火1 min,72℃1 min,共40个循环;最后在72℃延伸5 min.

洋葱(Alliumcepa L.)RAPD-PCR反应体系及扩增程序的优化

为建立多态性高、稳定性好的洋葱RAPD-PCR反应体系,采用正交设计,研究了Taq酶、Mg2+、引物和dNTP 4种RAPD-PCR反应组分浓度变化对扩增结果的影响,在此基础上对模板DNA用量、扩增程序中退火温度和反应循环次数进行了筛选。试验结果表明,洋葱20μl RAPD-PCR优化反应体系为1×Buffer、2.0 mmo1/L Mg2+、1.0 UTaqDNA聚合酶、200μmo1/L dNTP、0.6μmo1/L引物、2%甘油和15 ng DNA模板;PCR扩增程序为94℃预变性4 m in;94℃变性30 s,35℃退火40 s,72℃延长1.5 m in,45个循环;72℃保温延伸7 m in。

濒危竹种小蓬竹(Drepanostachyum luodianense)RAPD-PCR反应体系优化

为了建立小蓬竹(Drepanostachyum luodianense)RAPD-PCR反应的最优体系,以小蓬竹基因组DNA为模板,对影响其RAPD扩增的dNTPs浓度、模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶量、引物浓度、Mg2+浓度等重要参数进行了单因子和正交试验。试验得出小蓬竹RAPD最优反应体系为:20μL反应体系,10×PCR buffer为1/10体积,dNTPs为100μmol·L-1,模板DNA量为30 ng,Taq DNA聚合酶为1.0 U,引物浓度为0.2μmol·L-1,Mg2+浓度为1.5 mmol·L-1。优化后的RAPD-PCR反应程序为:94℃预变性5 min,然后进入35个循环,即94℃变性1 min,35℃退火30 s,72℃延伸90 s,循环完毕后于72℃延伸7 min,最后在4℃保持。

长心卡帕藻RAPD-PCR反应体系的正交优化研究

采用SD(S十二烷基硫酸钠,20%)法提取了大型海藻长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)基因组DNA。通过单因子梯度试验,确定了影响随机扩增DNA多态性(RAPD)扩增结果的模板、Mg2+、dNTPs、S22引物、Taq的适宜浓度、退火温度和反应的最佳循环次数;利用正交试验优化了模板、Mg2+、dNTPs、S22引物、Taq的配比浓度。结果表明,在进行长心卡帕藻的RAPD扩增时,在总体积为25μl的反应体系中,模板、Mg2+、dNTPs、S22引物、Taq的最佳浓度分别为15ng、2.0mmol/L、0.2mmol/L、0.25μmol/L、2.5U;退火温度为37℃。反应程序为94℃预变性5min,然后经94℃变性30s、37℃退火1min,72℃延伸2min,进行30次循环,最后在72℃再延伸10min。

狭叶坡垒RAPD-PCR反应体系优化

以濒危物种狭叶坡垒硅胶干燥的叶片为材料,研究其RAPD-PCR体系优化条件。结果表明,优化的狭叶坡垒RAPD-PCR反应体系为:25μL体系中1×PCR buffer,3 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTPs,0.5 U/25μL Taq聚合酶,0.4μmol/L引物,5 ng/μL DNA模板;最佳扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1.5min,35个循环;72℃最后延伸7 min。