洋葱(Alliumcepa L.)RAPD-PCR反应体系及扩增程序的优化

为建立多态性高、稳定性好的洋葱RAPD-PCR反应体系,采用正交设计,研究了Taq酶、Mg2+、引物和dNTP 4种RAPD-PCR反应组分浓度变化对扩增结果的影响,在此基础上对模板DNA用量、扩增程序中退火温度和反应循环次数进行了筛选。试验结果表明,洋葱20μl RAPD-PCR优化反应体系为1×Buffer、2.0 mmo1/L Mg2+、1.0 UTaqDNA聚合酶、200μmo1/L dNTP、0.6μmo1/L引物、2%甘油和15 ng DNA模板;PCR扩增程序为94℃预变性4 m in;94℃变性30 s,35℃退火40 s,72℃延长1.5 m in,45个循环;72℃保温延伸7 m in。

黄瓜DNA提取及其RAPD-PCR反应体系的优化

利用改良的 SDS方法提取黄瓜干种子与一步法提取的黄花苗总 DNA进行 RAPD扩增 ,其结果与传统的 CTAB和 SDS的结果一样。这两种方法不仅节约成本 ,且简单快速 ,大大降低了 DNA的提取难度 ,适宜黄瓜杂交种子纯度鉴定。不同组织材料对 RAPD无影响。研究了 RAPD的影响因素 ,改进及优化了 RAPD反应程序。结果表明 :Mg2 +浓度的范围为 1.5～ 3.0 mmol· L- 1 ,d NTPs浓度范围为 0 .15～ 0 .2 5 mmol· L- 1 ,Taq聚合酶浓度范围为 0 .5～ 1.5 U,模板DNA浓度为 2 0～ 10 0 ng,反应以及引物浓度为 0 .2～ 0 .4μmol· L- 1 。引物的碱基组成以及不同存放时间的引物对 RAPD扩增也有影响。 DNA预变性 94℃进行 4 min,94℃变性 30 s,37℃退火 30 s,72℃延伸 1min,循环 35次后

温郁金RAPD-PCR反应体系建立及条件优化

在提取纯化温郁金DNA的基础上,利用PCR扩增技术,对Mg2+、dNTP、模板DNA、引物、Taq聚合酶等反应条件进行优化,建立温郁金基因组DNA的RAPD-PCR最佳反应体系。结果表明:最佳条件是总体积为25μL,其中Mg2+(25mM)2μL,Taq聚合酶(5U/μL)0.3μL,引物浓度(20μM)1.0μL,模板DNA(5ng/μL)1.0μL,dNTP(2.5mM)2.0μL,10×PCRbuffer2.5μL;PCR扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性35s,36℃退火1min,72℃复性1.5min,共42个循环;最后72℃延伸10min,该研究得出的体系是温郁金RAPD-PCR的最适宜反应体系,具有省时、经济、简便以及扩增条带较清晰、稳定等特点,为今后温郁金的遗传多样性研究奠定了基础。

蜜蜂遗传多样性研究的RAPD-PCR反应体系的正交优化

利用正交设计L16(45)对蜜蜂基因组DNARAPD-PCR反应体系的5个因素(Tag酶,引物,Mg2+,dNTP,模板)在4个水平上进行优化试验,筛选出各个反应因素的最佳水平,建立蜜蜂模板DNARAPD-PCR反应的最佳体系(25L):10×PCRbuffer3.0L,Tag酶0.5U,引物浓度0.4mol/L,Mg2+浓度3.0mmol/L,dNTP浓度0.5mmol/L,模板40ng。对蜜蜂DNARAPD-PCR最佳反应体系的退火温度进行了梯度试验,最佳退火温度为54℃。

利用正交设计优化兴安落叶松RAPD-PCR反应体系

以兴安落叶松针叶DNA为模板,对影响落叶松RAPD-PCR扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立兴安落叶松RAPD-PCR反应的最佳体系。通过采用正交设计L16(45)对兴安落叶松RAPD-PCR反应的5因素(Taq酶、Mg2+、dNTP、模板DNA、引物)在4个水平上进行优化试验,结果表明兴安落叶松最佳的RAPD-PCR的反应体系(20μL)中含有模板90ng,0.5μmol·L-1的引物,1×反应缓冲液,DNTP各为0.25mmol·L-1,1U的TaqDNA聚合酶,Mg2+2.5mmol·L-1。在此基础上筛选出20个扩增稳定、多态性丰富的RAPD引物,并通过梯度PCR试验,确定了引物最佳退火温度。

淮山RAPD-PCR反应体系的建立

试验旨在获得最佳的淮山RAPD-PCR反应体系,供试材料来自海南大学农学院淮山资源圃。采用改良CTAB法提取淮山的叶片总DNA,通过单因子实验法分析DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度、Taq聚合酶以及Mg2+浓度对RAPD-PCR扩增结果的影响,建立了适合于淮山RAPD-PCR反应体系,即20μL体系中包括:模板DNA为50ng、Taq酶为0.2U、Mg2+浓度为3.0mmol/L、引物浓度为0.2μmol/L、dNTPs浓度为0.2mmol/L。

八角RAPD-PCR反应体系的建立及引物筛选研究

在提取高质量八角基因组DNA的基础上,通过对其RAPD反应体系的Taq DNA聚合酶、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度等因子的优化,建立了稳定、重复性高的八角RAPD-PCR反应体系。研究结果表明,在25μL PCR反应体系中,含1.0 UTaq DNA聚合酶,0.15 mmol.L-1 dNTPs,2.0 mmol.L-1 Mg2+,2.0μmol.L-1引物,20～80 ng模板。最佳反应程序为,94℃预变性5 min,扩增后94℃变性30 s,31～37℃退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环;72℃完全延伸7 min,4℃保存。在建立RAPD-PCR反应体系的基础上,从240条RAPD引物中筛选出15条扩增条带清晰、稳定性好的引物,并通过各引物的退火温度梯度实验,确定了各引物的最适退火温度。

极大节旋藻RAPD-PCR反应体系的比较及优化

以极大节旋藻基因组DNA为材料,比较了节旋藻RAPD-PCR常用反应体系与2×Taq Master Mix反应体系的不同之处及扩增效果,并对2×Taq Master Mix反应体系进行了优化实验,初步建立了较理想的极大节旋藻基因组DNA的RAPD-PCR反应体系:2×Taq Master Mix 4μL,随机引物1μL,模板DNA 1μL,ddH2O4μL.优化的反应体系操作简便快捷,扩增结果稳定.

干用辣椒RAPD-PCR反应体系及扩增程序的优化

以干用辣椒叶片为材料,研究了干用辣椒RAPD分析过程中的影响因素,包括Taq酶、Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA浓度、退火温度、退火时间及循环次数等,建立适合干用辣椒RAPD反应的PCR体系,即25μL反应体系中含有Taq酶1.5 U、Mg2+2.5 mmol/L,dNTPs 0.6mmol/L、引物0.8μmol/L、模板DNA 60 ng。扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性1 min,37℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,40个循环;最后72℃延伸5 min。该优化体系在干用辣椒RAPD分析中获得较理想的扩增结果,为应用RAPD技术对干用辣椒遗传多样性奠定基础。

应用正交设计优化江南牡丹RAPD-PCR反应体系

以牡丹品种"云芳"基因组DNA为模板,采用正交实验设计L25(55)对影响牡丹RAPD-PCR反应的5因素(模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs、Taq酶)在5个水平上进行优化试验。结果表明:最佳的RAPD-PCR的反应体系为:20μL体系中含有25 ng的模板DNA,0.2μmol/L的引物,Mg2+1.0 mmol/L,1×buffer反应缓冲液,DNTPs各为0.2 mmol/L,1.0 U的TaqDNA聚合酶。

花椰菜RAPD-PCR反应体系的优化

采用正交法对影响花椰菜RAPD-PCR反应的5个实验因素进行了优化,结果表明,花椰菜RAPD反应的优化体系为:dNTPs 0.12 mmol/L.引物0.8～1.6 μmol/L,模板DNA为20～80 ng,Taq酶为0.75 U,退火温度34～36℃.试验证明,Taq酶用量对RAPD-PCR反应体系的影响最大,退火温度、引物浓度、dNTPs用量对RAPD-PCR反应结果影响均小于Taq用量,但相差不大.模板浓度的影响最小.

适于核桃的RAPD-PCR反应体系的建立

采用CTAB法和改进的CTAB法,从叶片中提取核桃基因组DNA,比较其分离效果。结果表明,改进的CTAB法可有效去除细胞内多糖和多酚等杂质对模板DNA的污染。并以此为模板进行RAPD反应,对RAPD反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化试验,建立适合于核桃的RAPD-PCR反应体系,以进行该树种的分子标记研究。

星星草RAPD-PCR反应体系建立与优化

目的:寻找一个可用于星星草(Puccinellia tenuiflora(Griseb.)Scribn.et Merr)RAPD-PCR的最适宜的反应体系。方法:利用正交设计法对影响PCR扩增效果的一些因素诸如TaqDNA聚合酶的用量、Mg2+浓度、dNTP以及引物浓度等指标进行筛选和优化。然后,通过引物对该优化结果进行验证。结果:正交设计结果表明,最适宜的PCR反应条件:20μl PCR反应体系中包括10×buffer2μl、模板DNA20ng、dNTP1.6mmol/L、TaqDNA聚合酶0.35U、引物1.0mmol/L、Mg2+1.8mmol/L。验证结果表明,该体系扩增出的条带多且清晰。结论:该研究得出的体系是适合RAPD-PCR的最适宜的反应体系,为今后星星草遗传多样性的研究奠定了基础。

异地板蓝根基因组DNA指纹图谱建立及RAPD-PCR反应体系优化

目的:采用RAPD法研究不同地区板蓝根基因组DNA遗传差异性,药材的真假。方法:利用RAPD(random amplified polymorphic DNA)技术,在分子水平上对不同地区板蓝根基因组DNA进行了遗传差异性分析,同时优化板蓝根RAPD-PCR反应体系。结果:指纹图谱显示出不同地区板蓝根资源丰富的遗传多样性,可以辨别出药材的真假和优劣。结论:RAPD技术为鉴别中药材板蓝根真伪和优劣提供了现实意义,为临床安全和合理用药提供理论依据,并建立适合板蓝根RAPD-PCR的最佳反应体系。

松材线虫RAPD-PCR反应体系的优化与分子鉴定标记的筛选

应用随机引物S344、S356和S360比较分析了PCR热循环复性温度、Mg^2＋浓度和模板浓度对松材线虫基因组DNA的RAPD扩增结果的影响，旨在建立松材线虫的最佳反应体系，并以此进行松材线虫的分子鉴定标记筛选。结果表明：37℃的复性温度、3．0mmol·L^-1Mg^2＋、10μL反应体系中松材线虫基因组DNA模板1～25ng是研究松材线虫RAPD特征的最佳反应体系。利用此反应体系，通过对100个随机引物的分析，获得了3条松材线虫区别于拟松材线虫的分子鉴定标记。

美花石斛RAPD-PCR反应体系的建立

目的建立美花石斛基因组DNA的RAPD-PCR最佳反应体系。方法在提取纯化美花石斛基因组DNA的基础上,利用PCR扩增技术和方法,对Mg2+,dNTP,模板DNA,引物,Taq聚合酶等反应条件进行优化。结果反应体系的最佳条件是总体积为25μl,其中Mg2+浓度1.2 mmol.L-1,Taq聚合酶1.2U,引物浓度0.3 mmol.L-1,模板DNA 46 ng和dNTPs 160 mmol.L-1;PCR扩增程序为94℃预变性3 min,94℃变性50 s,40℃退火1 min,72℃延伸2 min,循环40次,72℃延伸5 min。结论该反应体系具有经济,简便以及扩增条带较清晰而稳定等特点。

优化萝卜基因组DNARAPD-PCR反应体系的正交设计法

以CTAB微量提取方法提取10个红萝卜雄性不育系A单株的基因组DNA,等浓度混合成基因池。以其为模板,用正交设计方法论定RAPD-PCR反应体系的各影响因子,用随机引物S42(5'GGACCCAACC3')优化萝卜雄性不育系A基因组DNARAPD-PCR反应体系,16次试验即可获得最佳的RAPD-PCR反应体系。

黄皮RAPD-PCR反应体系的优化

以5′-GTCGTTCCTG-3′为随机引物,以酸黄皮为试材,对黄皮RAPD反应体系进行了优化研究,结果表明:20μL反应体系中,Taq DNA聚合酶、Mg2+、随机引物、模板DNA和dNTPs 5种主要成分的适宜浓度和用量分别为2.0 U、2.5 mmol/L、0.5 umol/L、50 ng、0.20 mmol/L。适宜的扩增程序为94℃预变性3 min,1个循环;94℃变性45 s,36℃退火45 s,72℃延伸1 min,38个循环;72℃后延伸7 min。

长心卡帕藻RAPD-PCR反应体系的正交优化研究

采用SD(S十二烷基硫酸钠,20%)法提取了大型海藻长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)基因组DNA。通过单因子梯度试验,确定了影响随机扩增DNA多态性(RAPD)扩增结果的模板、Mg2+、dNTPs、S22引物、Taq的适宜浓度、退火温度和反应的最佳循环次数;利用正交试验优化了模板、Mg2+、dNTPs、S22引物、Taq的配比浓度。结果表明,在进行长心卡帕藻的RAPD扩增时,在总体积为25μl的反应体系中,模板、Mg2+、dNTPs、S22引物、Taq的最佳浓度分别为15ng、2.0mmol/L、0.2mmol/L、0.25μmol/L、2.5U;退火温度为37℃。反应程序为94℃预变性5min,然后经94℃变性30s、37℃退火1min,72℃延伸2min,进行30次循环,最后在72℃再延伸10min。

药用植物雷公藤RAPD-PCR反应体系优化研究

采用单因子梯度试验法对影响雷公藤RAPD-PCR反应的Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶的用量及DNA模板浓度进行了筛选。结果表明获得清晰、重复性高的雷公藤RAPD-PCR扩增条件为:20μL PCR反应体积中,2.0 mmol·L-1 MgCl2,0.2 mmol·L-1 dNTPs,0.2μmol·L-1引物,50 ng模板DNA,1UTaq DNA聚合酶。