焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子甲基化方法的建立

目的:建立基因启动子甲基化的焦磷酸测序检测方法,为基因启动子甲基化标志物的检测奠定基础.方法:从正常人全血中提取基因组DNA.采用复合巢式PCR的方法扩增目的基因,克隆构建对照标准品质粒.使用甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子CpG岛的5个甲基化位点,双脱氧测序验证.将阳性和阴性对照标准品质粒PCR扩增产物按不同比例混合后进行焦磷酸测序,检测每个点的甲基化程度,制作校正曲线.结果:构建了甲基化特异性焦磷酸测序阴性对照和阳性对照标准品.经焦磷酸测序检测后,阴性对照标准品甲基化程度为0%,阳性对照标准品甲基化程度为100%,与双脱氧测序结果一致.经对混合样品检测,甲基化频率符合线性关系,线性相关性大于0.99,斜率约为1,并且所有位点的标准偏差约为1%.结论:成功构建了甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2启动子区域甲基化阳性对照和阴性对照标准品质粒.建立了甲基化特异性焦磷酸测序检测基因启动子甲基化的方法.

循环肿瘤DNA中TSHR、RARβ2和RASSF1A启动子甲基化在甲状腺癌早期诊断中的价值

目的研究甲状腺结节患者循环肿瘤DNA中TSHR、RARβ2和RASSF1A启动子甲基化状态,探讨其在甲状腺癌早期诊断中的价值。方法采用甲基化特异性PCR(MSP)对16例甲状腺癌患者和59例良性甲状腺结节患者循环肿瘤DNA中TSHR、RARβ2和RASSF1A基因启动子甲基化进行检测,分析其甲基化率与临床病理之间的关系,并评价其临床诊断效能。结果 TSHR在甲状腺癌组甲基化率为56.3%,与良性结节组(37.3%)间差异不显著(P>0.05);RARβ2和RASSF1A在甲状腺癌组甲基化率分别为37.5%和62.5%,均显著高于良性结节组(3.4%,22%),P<0.01。TSHR基因甲基化率在甲状腺癌患者性别、年龄、不同临床分期间均无统计学差异(P>0.05);RARβ2和RASSF1A基因甲基化率在状腺癌患者性别、年龄间无统计学差异,但与不同临床分期有关(P<0.05)。临床诊断效能比较显示:单独检测RASSF1A基因敏感度和Yonden指数最高,而RARβ2特异性最高。三个基因联合检测,其敏感度、特异性和Yonden指数均最高。结论 TSHR、RARβ2和RASSF1A基因异常甲基化与甲状腺癌发生发展相关,三者联合检测有助于甲状腺癌的诊断。

RNA干涉技术在宫颈癌相关HPV及RARβ2研究中的应用

宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤,其发生与发展是多因素共同参与的结果。除高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌的关系密切外,肿瘤抑制基因的表达沉默是十分重要的参与因素,且多为表观调节引起。其中维甲酸受体β2(RARβ2)的表达沉默相当普遍,但上述二者致病的关系不明。RNA干扰(RNAi)是近年来发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术,可以通过在细胞内引入设计的外源双链RNA诱导细胞内特定基因的沉默,从而观察相关生物因子的变化。该文就在有关宫颈癌细胞系中通过RNAi干扰HPV表达观察RARβ2表达及其表观遗传学改变的最新结果进行综述,旨在了解HPV与RARβ2之间的关系,进一步探索对宫颈癌发生机制的认识。

COX-2、RAR-β2在食管鳞状细胞癌组织中的表达及相互关系

目的观察食管鳞癌(ESCC)组织中维甲酸β2受体(RAR-β2)、环氧化酶2(COX-2)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及Akt的表达情况,探讨其表达异常在食管癌发生发展过程中的作用、相关临床病理意义及相互关系。方法①利用qRT-PCR技术检测33例ESCC新鲜组织及正常食管黏膜组织中RAR-β2与COX-2 mRNA的表达水平,分析其临床病理意义及其相互关系。②利用免疫组织化学染色技术研究mTOR与Akt等蛋白在94例正常食管黏膜组织及ESCC石蜡包埋组织中的表达情况,分析其临床病理意义,并试探讨此通路与RAR-β2表达间的相互关系。结果①与相应正常食管黏膜组织相比,ESCC组织中COX-2 mRNA表达明显上调,而RAR-β2 mRNA表达下调(P<0.05)。Ⅰ-Ⅱ级ESCC组织中RAR-β2 mRNA的表达明显高于Ⅲ级ESCC组织(P<0.05);且RAR-β2的表达与患者是否喜好热烫饮食(T≥70℃)关系密切(P<0.05)。而COX-2 mRNA的表达与患者是否喜好腌制食物显著相关(P<0.05)。ESCC组织中RAR-β2与COX-2表达呈负相关(P=0.013)。②与相应正常食管黏膜组织相比,ESCC组织中mTOR和Akt蛋白表达明显上调。在正常食管黏膜组织及ESCC组织中,mTOR蛋白的阳性率分别是28.6%、52.1%,差异有统计学意义(χ2=10.175,P<0.05);Akt的阳性率分别为20.2%及42.6%,差异有统计学意义(χ2=10.148,P<0.05)。结论 RAR-β2、COX-2的表达与ESCC有密切关系,COX-2 mRNA及Akt、mTOR蛋白在ESCC组织中表达上调,而RAR-β2mRNA在ESCC组织中表达下调。