全反式视黄酸通过RARγ蛋白直接调控PPARγ2蛋白抑制骨髓间充质干细胞成脂分化

目的研究高浓度全反式视黄酸(atRA)抑制大鼠骨髓间充质干细胞(r BMSCs)成脂分化过程中,视黄酸核受体γ(RARγ)对过氧化物酶体增殖激活受体γ2(PPARγ2)与CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)调控的机制。方法体外分离、培养、诱导r BMSCs。成脂分化诱导液中,加入0.5、1.0μmol/L atRA持续作用15 d后,real-time PCR和Western blotting分别检测RARγ、C/EBPα、PPARγ2的mRNA和蛋白表达水平。重组腺病毒过表达RARγ(over-RARγ)、沉默RARγ(si-RARγ)分别感染BMSCs,采用real-time PCR及Western blotting检测RARγ、C/EBPα、PPARγ2的mRNA及蛋白表达水平。Co-IP检测1.0μmol/L atRA持续成脂诱导15 d后,明确RARγ与PPARγ2两者之间是否有相互作用。结果诱导15 d结束时,与对照组相比,加入0.5、1.0μmol/L atRA后,RARγ表达明显增加(P<0.01,P<0.001),而PPARγ2、C/EBPα表达明显降低(P<0.001)。over-RARγ组:RARγmRNA和蛋白表达均较对照组明显增加(P<0.01),而PPARγ2、C/EBPαmRNA和蛋白表达均较对照组明显降低(P<0.05,P<0.01)。si-RARγ组:RARγ蛋白表达较对照组明显减低,但PPARγ2、C/EBPα却无明显变化。Co-IP结果提示:RARγ与PPARγ2蛋白之间有直接作用,形成复合物,未发现其与视黄酸反应元件(RARE)相结合证据。结论高浓度atRA抑制r BMSCs成脂分化,是通过激活视黄酸信号通路RARγ而实现的。RARγ下调成脂分化通路PPARγ2、C/EBPα表达是通过直接作用于下游的PPARγ2蛋白而实现的。

PML/RARɑ阳性APL缓解后继发PML/RARɑ阴性AML 1例报道

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)作为急性粒细胞白血病中的特殊类型,发病凶险,常常并发弥散性血管内凝血,大部分患者通过早期诊断,予以亚砷酸和全反式维A酸(all-trans retinoic acid,ATRA)治疗可完全缓解,核型恢复正常,但仍有5%~30%的患者在完全缓解后复发[1]。

中间偃麦草RAR1基因的分离及其在小麦背景中的功能分析

【目的】RAR1是大麦抗白粉病基因和多种植物抗病(resistance,R)基因介导的抗病信号途径中的重要信号元件。为明确RAR1在小麦抗白粉病反应中的作用,为小麦广谱抗病分子育种提供基因资源,开展了本研究。【方法】采用生物信息学技术、RT-PCR和RACE方法分离克隆中间偃麦草RAR1基因,通过酶切和连接构建该基因的单子叶高效表达载体,采用基因枪法转化小麦,对转基因小麦植株进行分子检测、表达分析和抗病鉴定。【结果】分离克隆出中间偃麦草RAR1基因,其编码蛋白具有典型的RAR1功能结构域;构建了中间偃麦草RAR1基因的单子叶高效表达载体pUBI∷RAR1;用基因枪法轰击小麦推广品种扬麦12幼胚愈伤组织1545个,获得152株再生植株,通过PCR检测出阳性植株18株,转化率为1.17%;对T1、T2代转基因材料进行PCR检测、RT-PCR分析和白粉病抗病鉴定,结果表明转入的RAR1基因能够在小麦背景中遗传,RAR1基因的超量表达可提高小麦对白粉病菌的抗性、拓宽小麦的抗病谱。【结论】分离出中间偃麦草RAR1基因,RAR1基因在小麦中超量表达可提高小麦对白粉病菌的抗性、拓宽其抗病谱,可以作为小麦白粉病广谱抗性分子育种的潜在的重要基因资源。

实时定量PCR检测46例初诊急性早幼粒细胞白血病患者PML/RARα mRNA的分子表达

本研究探讨实时定量PCR(Q-PCR)检测PML/RARαmRNA的方法学,并对46例初诊急性早幼粒细胞白血病(APL)患者骨髓标本进行检测。构建PML/RARα的bcr1型和bcr3型转录本以及内参照abl基因转录本的阳性标准品质粒;利用ABI Prism7500型Q-PCR仪对46例初诊APL患者和40例非APL患者骨髓标本进行检测,PML/RARαmRNA定量结果以校正比值(NQ)表示,NQ=PML/RARαmRNA拷贝数/ABLmRNA拷贝数;应用四色流式细胞术检测免疫表型。结果显示,Q-PCR结果的日间差和日内差平均变异系数(CV)分别为1.58%和0·88%。可重复敏感度为可以检测5copies/100ng RNA。40例非APL患者PML/RARαmRNA均为阴性。46例初诊APL患者PML/RARαmRNA表达量NQ中位值为0.450(0.084-1.082)。比较32例bcr1型和14例bcr3型两组患者的特征表明,PML/RARαmRNA NQ中位值分别为0.454(0.084-1.082)和0.386(0.151-0.848)(P>0·05)。形态学诊断M3v的患者比例分别为9.40%和48.96%(P<0.05);初诊时WBC中位数分别为2.15(0.2-59.6)和9·35(0.91-122.8)(P<0.05),而在性别、年龄、初诊时血红蛋白和血小板计数、骨髓中APL细胞比例、DIC指标等方面无差异。流式细胞仪术检测时,CD45/SSC射门情况下,APL细胞群分布可以分为两类:高侧向角(L-SSC,粗颗粒)和非高侧向角(NL-SSC,细颗粒)两类。bcr1型患者中85.70%表现为L-SSC,而bcr3型患者中64·29%表现为NL-SSC。结论:建立的Q-PCR方法稳定可靠,敏感度高;bcr1型和bcr3型APL患者的PML/RARαmRNA表达量无差异,bcr3型APL患者中形态学M3v比例和WBC数比bcr1型患者高;PML/RARα不同转录本类型和免疫表型以及细胞形态学之间有一定的相关性。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα异型的临床意义

为评价急性早幼粒细胞白血病(APL)PML/RARα异型与临床治疗及预后的相关性,对71例诱导治疗的APL患者定期进行血像、骨髓像检查,用巢式RT-PCR检测PML/RARα不同转录本。结果表明:短型(S)和V型白细胞总数比长型(L型)显著升高,所以较易早期发生严重的出血合并症。S型和V型PML/RARα患者的复发率高于L型患者。结论:APL患者PML/RARα异型可作为独立的预后因素。

杂交山猪骨骼肌PPARγ、RARα基因与脂代谢关系的研究

以3个山猪杂交组合为对象,分别测定18头猪的体脂和背最长肌(LD)脂代谢表观性状及LD肌细胞上PPARγ和RARα基因,研究上游基因对脂代谢的调控作用。首先优化该基因扩增条件,并采用qRT-PCR荧光定量技术检测LD肌细胞上PPARγ和RARα基因表达量。结果表明,PPARγ和RARα基因均可在骨骼肌细胞上有效表达并与体脂和IMF代谢间呈一定关联度。1/2山猪血统母猪骨骼肌细胞PPARγ和RARα基因表达量均较高,且呈现PPARγ基因为主导的脂肪合成代谢倾向,表现为皮下和肌内BF和IMF明显增加,肉质改善(p<0.05和p<0.01)。1/4山猪血统的杂交公猪和母猪骨骼肌细胞PPARγ基因表达量趋于下降,在雄性激素伴随下DDS的RARα基因升高,呈现RARα基因主导下抑制皮下或肌内脂肪原母细胞分化,脂肪沉积量明显减少。

RARβ在胃癌细胞生长调节中的作用

为探讨 RARβ受体介导全反式视黄酸 ( ATRA)抑制胃癌细胞生长的作用机理 ,用 Northern印迹测定 RARβ m RNA表达水平 ,脂质体介导的转染方法将含有 RARβ基因的表达载体转染MKN- 45细胞并稳定表达 ,MTT和软琼脂集落形成等实验测定细胞生长速率和生长状态 ,氯霉素乙酰转移酶活性 ( CAT)测定视黄酸应答元件βRARE的转录活性以及 AP- 1 ( activator protein- 1 )活性 .RARβ在 ATRA敏感细胞株 MGC80 - 3、BGC- 82 3和 SGC- 790 1中表达 ,而在 ATRA抗性细胞株 MKN- 45中不表达 .当 RARβ基因转染 MKN- 45细胞时 ,细胞变为 ATRA敏感 ,由此导致ATRA抑制 MKN- 45细胞生长和软琼脂集落形成 .ATRA可以加强诱导 MGC80 - 3、BGC- 82 3和SGC- 790 1细胞βRARE的转录活性 ,但对 MKN- 45细胞影响不大 ,不能抑制细胞 AP- 1活性 .当RARβ基因转染 MKN- 45细胞后 ,ATRA则能够诱导细胞 βRARE的转录活性 ,并抑制细胞的 AP-1活性 .RARβ表达与 ATRA抑制胃癌细胞生长密切相关 .ATRA诱导 βRARE转录活性和抑制AP- 1活性可能是其调控胃癌细胞生长的机制之一 .

胃癌细胞中AP-1活性与RARα介导的相关性

为确定全反式视黄酸 ( ATRA)抑制胃癌细胞 AP- 1活性过程中 RARα介导的作用机理 ,利用 Northern印迹和 Western印迹测定 RARα基因和 c Jun、c Fos蛋白表达水平 ;氯霉素乙酰转移酶活性 ( CAT)分析 AP- 1活性 ;以及 MTT法检测细胞生长速率 .结果表明 ,ATRA能够诱导 RARα表达 ,抑制 c Jun和 c Fos蛋白表达和 AP- 1活性 ,由此导致胃癌细胞生长抑制 .结果证实 ,ATRA抑制胃癌细胞 AP- 1活性是抑制细胞生长的重要途径之一 ,并与 RARα介导密切相关 .

实时定量PCR监测急性早幼粒细胞白血病患者PML/RARα融合基因的临床意义

目的探讨实时定量PCR检测急性早幼粒细胞白血病(APL)PML/RARα融合基因表达水平的意义。方法用扩增培养的NB4细胞的PML/RARα融合基因进行梯度稀释作为标准品,ABL作为内参,建立标准曲线。采用Taq Man法进行实时定量PCR,并对方法的可靠性、可重复性及灵敏性进行测定。对14例APL患者在初治、诱导缓解及巩固治疗3个时期的PML/RARαmRNA转录本水平进行动态定量监测,结果以NQ表示,NQ=PML/RARαmRNA的拷贝数/ABL mRNA的拷贝数×105。结果实时定量PCR方法可以检测出1×10-5μg NB4细胞cDNA中PML/RARα的融合基因,其重复性和稳定性Ct值变异系数分别为1.77%和2.11%。14例患者初治时骨髓PML/RARα融合基因平均水平为3 731,经全反式维甲酸、三氧化二砷双诱导缓解时PML/RARα融合基因平均水平为231,化疗与维甲酸序贯巩固治疗2个疗程后PML/RARα融合基因平均水平为116。治疗前后比较,PML/RARα基因转录本水平明显下降(P<0.05)。结论实时定量PCR检测PML/RARα融合基因表达敏感性好、特异性高、重复性好,可用于急性早幼粒细胞的诊断和微小残留病的检测。

ATRA对甲状腺鳞癌细胞生长及RARβ和p21mRNA表达的影响

目的观察全反式维甲酸(ATRA)对甲状腺鳞癌SW579细胞株生长增殖及维甲酸受体β(RARβ)和p21表达的影响,进而探讨维甲酸的抗癌作用机制。方法甲状腺鳞癌SW579细胞株经不同浓度ATRA作用48h后,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化;MTT法测定细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞周期;RT-PCR方法检测细胞RARβ及p21mRNA的表达。结果随着ATRA的升高,SW579细胞的生长呈显著抑制状态,细胞生长滞留在G1期,RARβ和p21mRNA表达水平均显著上调,呈剂量依赖性。结论 ATRA在一定浓度范围内对甲状腺鳞癌SW579细胞株有剂量依赖性的增殖抑制作用,其机制可能与提高细胞RARβ基因的表达、进而再上调p21的表达有关。

PML-RARα及RARα融合蛋白在三硫化二砷诱导的NB4细胞凋亡中的作用研究

为研究PML RARα及RARα融合蛋白在三硫化二砷 (As2 S3 )诱导的人早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞凋亡中的作用 ,本研究应用细胞形态观察、流式细胞术测定及DNA电泳等方法观察三硫化二砷对NB4细胞的诱导凋亡作用 ,用染色体G显带技术、反转录PCR及Western印迹测定这一过程中PML RARα融合基因及其表达产物、野生型RARα蛋白的变化。结果表明 ,三硫化二砷在 0 .5 - 2 μmol/L之间能诱导NB4细胞凋亡 ,在此过程中PML RARα融合基因无明显变化 ,但PML RARα融合蛋白和野生型RARα蛋白明显减少。结论提示PML

焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子甲基化方法的建立

目的:建立基因启动子甲基化的焦磷酸测序检测方法,为基因启动子甲基化标志物的检测奠定基础.方法:从正常人全血中提取基因组DNA.采用复合巢式PCR的方法扩增目的基因,克隆构建对照标准品质粒.使用甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子CpG岛的5个甲基化位点,双脱氧测序验证.将阳性和阴性对照标准品质粒PCR扩增产物按不同比例混合后进行焦磷酸测序,检测每个点的甲基化程度,制作校正曲线.结果:构建了甲基化特异性焦磷酸测序阴性对照和阳性对照标准品.经焦磷酸测序检测后,阴性对照标准品甲基化程度为0%,阳性对照标准品甲基化程度为100%,与双脱氧测序结果一致.经对混合样品检测,甲基化频率符合线性关系,线性相关性大于0.99,斜率约为1,并且所有位点的标准偏差约为1%.结论:成功构建了甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2启动子区域甲基化阳性对照和阴性对照标准品质粒.建立了甲基化特异性焦磷酸测序检测基因启动子甲基化的方法.

动态监测PML-RARα融合基因对急性早幼粒细胞白血病的临床意义

目的动态监测急性早幼粒细胞白血病(APL)特有的PML-RARα基因,并探讨其临床意义。方法15例APL患者用全反式维甲酸(ATRA)和其他化疗药物进行诱导缓解、巩固和维持治疗,并进行随访,在病程的不同阶段采集骨髓标本进行形态学检查,并采用实时定量PCR(RQ-PCR)技术检测PML-RARα基因表达。结果15例APL患者入院时PML-RARα均为阳性,治疗中死亡1例、完全缓解14例(93%)。14例完全缓解患者中2例复发,13例在病程中PML-RARα转为阴性。2例复发患者中,1例PML-RARα持续阳性,1例在病程中由阴性转为阳性。13例仍生存者中,至少已连续3次PML-RARα为阴性。结论对APL患者跟踪检测PML-RARα融合基因可早期发现复发病例;RQ-PCR检测PML-RARα对APL诊断、疗效判定及微小残留病变监测是一种有力手段。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因筛查及实时定量检测平台的建立

目的:针对90%以上的急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者表达的PML/RARα融合基因,设计引物及探针。对APL患者进行基因筛查,并构建PML/RARα环形质粒作为标准品,建立APL患者PML/RARα融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,为APL患者的诊治提供分子生物学依据。方法:设计PML/RARα及ABL引物及Taqman探针,对APL患者进行基因筛查。并以PML/RARαL型及S型阳性的APL患者cDNA为模板,应用PCR技术扩增出453bp和550bp基因片段,构建pMD 18TPML/RARα(L)及pMD 18T-PML/RARα(S)标准品。实时荧光定量(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技术对该基因转录本水平的变化情况进行监测。结果:成功构建pMD 18T-PML/RARα质粒标准品,应用RQ-PCR技术,以ABL为内参,应用Taqman探针法,对APL患者标本进行检测,技术可行,数据稳定。结论:成功构建APL融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,应用于临床病人的基因诊断,为APL的诊治提供了可靠的分子依据。

应用荧光原位杂交技术动态观察急性早幼粒细胞白血病患者PML-RARα融合基因的变化

目的:探讨荧光原位杂交(FISH)技术在急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断及疗效判断中的作用。方法:对初发的急性白血病患者行常规形态学、细胞化学染色,并采用FISH技术检测PMLRARα融合基因,流式细胞术分析白血病细胞的免疫表型,对治疗过程中患者PMLRARα融合基因阳性细胞比例进行动态观察。结果:FISH对标准的PML-RARα融合基因的检出与形态学和临床符合率为100%,对流式细胞学免疫表型不符合的APL诊断的1例作出了明确诊断,对累及17号染色体的附加染色体异常也有一定的提示作用,对APL治疗过程中分子生物学缓解的判断非常直观。结论:FISH技术检测PMLRARα融合基因,实验方法简便、快速、直观和准确,具备了用以确定白血病类型,指导临床治疗和进行治疗后的疗效监测的作用。

PML-RARα和hGM-CSF双基因表达载体的构建

目的:构建急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARα基因与人粒巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因真核双表达载体,为利用DNA疫苗治疗APL奠定基础。方法:利用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增出PML-RARα融合点附近的部分基因片段,通过PCR从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因,并分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点(MCS)A和B中,构建真核双表达载体。利用酶切和序列分析方法验证所构建载体的正确性。结果:NheI/M luI和XbaI/SalI双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hGM-CSF基因,且序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。结论:成功构建了含有PML-RARα基因及hGM-CSF基因的真核双表达载体。

PLZF-RARα/RARα-PLZF双阳性转基因小鼠发生白血病模型研究

本研究目的是从生物整体水平上研究PLZFRARα/RARαPLZF双融合基因的表达在急性早幼粒细胞白血病(APL)发病中的作用及发病机制。通过交配建立PLZFRARα/RARαPLZF双阳性转基因小鼠(TM)模型;采用PCR、RTPCR方法检测融合基因的整合和表达;应用血象、骨髓象、病理和流式细胞术等对疾病表型进行检测分析;并观察全反式维甲酸(ATRA)或ATRA与tricostatinA(TSA)联合用药对PLZFRARα/RARαPLZF双阳性转基因小鼠骨髓细胞的作用。结果表明,在近18个月的时间观察到51只PLZFRARα/RARαPLZF双阳性转基因小鼠中有5只小鼠发病,发病率约10%,与我所同期的仅PLZFRARα转基因阳性小鼠11.3%的发病率相似。发病时间均在6月龄以后,与PLZFRARα转基因阳性发病小鼠相比示提前,但疾病表型不同,2只(40%)为急性早幼粒细胞白血病(APL)改变,3只(60%)为慢性粒细胞白血病(CML)改变。ATRA处理组的骨髓细胞形态无改变,而ATRA+TSA组骨髓原始细胞核浆比例降低,染色质固缩,呈现粒细胞分化趋势。结论PLZFRARα/RARαPLZFTM小鼠发病存在异质性,其骨髓细胞对ATRA无反应,而ATRA与TSA联合用药可诱导骨髓原始早幼粒细胞分化。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因检测的临床意义

目的探讨荧光原位杂交技术(FISH)检测PML/RARα融合基因在急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断中的应用价值。方法应用常规细胞遗传学分析28例APL患者的染色体核型,同时用FISH法检测PML/RARα融合基因。结果 28例初诊的APL患者254例常规核型分析检出t(15;17)(q22;q12);2例患者核型正常;另1例未检出t(15;17),核型分析结果为涉及15和17号染色体的复杂异常;FISH检测所有病例均存在PML/RARα融合基因。结论 FISH法行PML/RARα融合基因检测特异性和敏感性好,是诊断APL的可靠方法。

COX-2、RAR-β2在食管鳞状细胞癌组织中的表达及相互关系

目的观察食管鳞癌(ESCC)组织中维甲酸β2受体(RAR-β2)、环氧化酶2(COX-2)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及Akt的表达情况,探讨其表达异常在食管癌发生发展过程中的作用、相关临床病理意义及相互关系。方法①利用qRT-PCR技术检测33例ESCC新鲜组织及正常食管黏膜组织中RAR-β2与COX-2 mRNA的表达水平,分析其临床病理意义及其相互关系。②利用免疫组织化学染色技术研究mTOR与Akt等蛋白在94例正常食管黏膜组织及ESCC石蜡包埋组织中的表达情况,分析其临床病理意义,并试探讨此通路与RAR-β2表达间的相互关系。结果①与相应正常食管黏膜组织相比,ESCC组织中COX-2 mRNA表达明显上调,而RAR-β2 mRNA表达下调(P<0.05)。Ⅰ-Ⅱ级ESCC组织中RAR-β2 mRNA的表达明显高于Ⅲ级ESCC组织(P<0.05);且RAR-β2的表达与患者是否喜好热烫饮食(T≥70℃)关系密切(P<0.05)。而COX-2 mRNA的表达与患者是否喜好腌制食物显著相关(P<0.05)。ESCC组织中RAR-β2与COX-2表达呈负相关(P=0.013)。②与相应正常食管黏膜组织相比,ESCC组织中mTOR和Akt蛋白表达明显上调。在正常食管黏膜组织及ESCC组织中,mTOR蛋白的阳性率分别是28.6%、52.1%,差异有统计学意义(χ2=10.175,P<0.05);Akt的阳性率分别为20.2%及42.6%,差异有统计学意义(χ2=10.148,P<0.05)。结论 RAR-β2、COX-2的表达与ESCC有密切关系,COX-2 mRNA及Akt、mTOR蛋白在ESCC组织中表达上调,而RAR-β2mRNA在ESCC组织中表达下调。

RARβ在宫颈癌及癌前病变中的表达调控和意义

目的:宫颈癌组织中的维甲酸受体β(retinoic acid receptor beta,RARβ)基因启动子区发生异常甲基化,一般提示其抑制基因的转录表达。本研究从mRNA和蛋白质水平观察宫颈癌发生与RARβ表达调控的关系和意义。方法:选择妇女宫颈炎、宫颈内上皮瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈鳞癌患者,收集新鲜组织标本37例及石蜡包埋组织126例,采用定量RT-PCR及免疫组织化学方法鉴定RARβmRNA及蛋白质表达水平。结果:1)与宫颈炎相比,RARB基因在CIN和宫颈癌组织中的mRNA表达水平明显下降,但是CIN与宫颈癌之间没有统计学差异(P>0.05)。2)RARβ蛋白在宫颈上皮细胞核正常表达,少数病例出现"部分缺失"(8%),但是随着CIN和宫颈癌发病进程,不仅发生"完全缺失",而且其缺失频率逐渐增高(38%和57%),与宫颈炎比较有显著差异(P<0.01)。结论:在宫颈癌及癌前病变组织中,RARβ转录水平表达下调及蛋白质水平表达出现缺失,可能是肿瘤发生的重要标志。本结果为进一步研究该基因异常甲基化相关的机制,并建立宫颈癌的生物标志物体系提供了客观依据。