全反式维A酸对卵巢上皮性腺癌细胞株COC2中RARa基因甲基化影响的研究

目的:全反式维A酸是一种经典的诱导肿瘤细胞分化的药物,但关于其对肿瘤细胞的异常甲基化的影响,国内研究仍很少,文中通过观察全反式维A酸(ATRA)对卵巢上皮性腺癌细胞株COC2中RARa基因启动子甲基化位点的影响,及其对RARa基因mRNA表达的影响,探讨ATRA对RARa基因启动子区异常甲基化可能的作用。方法:用不同浓度及作用时间的ATRA体外干预COC2细胞,甲基化特异性PCR及基因测序法检测用药前后COC2细胞中RARa启动子区甲基化状态的改变。RT-PCR法检测各组RARa基因mRNA表达的改变。结果:COC2细胞中存在RARa基因启动子区异常甲基化;不同浓度ATRA处理后,RARa启动子的异常甲基化位点出现部分逆转,并在一定范围内表现出浓度及时间依赖性,RARa基因的mRNA表达也同样表现为增高趋势。结论:COC2细胞中存在RARa基因启动子区异常高甲基化;ATRA可以部分逆转RARa启动子区的异常甲基化位点并增加RARamRNA的表达。

实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARa融合基因

本研究旨在建立用实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARa mRNA的方法,探讨APLPML-RARa融合基因表达水平与疗效的关系。用RT-PCR扩增培养的NB4细胞的PML-RARa融合基因,取1μgNB4细胞的总cDNA进行10倍的梯度稀释,作为标准品,建立荧光定量RT-PCR方法,对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行了测定。定量检测4例急性早幼粒细胞白血病(APL)患者治疗前后骨髓内PML-RARa融合基因转录本水平,并对1例经治疗完全缓解后又复发的患者PML-RARa转录本水平(拷贝数)进行动态监测。结果表明:用本研究建立的实时定量RT-PCR方法可检测出10-5μgNB4细胞cDNA中的PML-RARa融合基因,其重复性的CT值,管间、批间变异系数(CV)分别为2.1%、3.8%。4例患者初治骨髓PML-RARa基因转录本水平的分别为1884、5533、1803、4677拷贝,平均为3475拷贝。经ATRA+化疗治疗后其PML-RARa基因转录水平下降至40、135、79、229拷贝,平均为121拷贝。还有1例患者治疗前PML-RARa基因转录本水平为8600拷贝,经过4个月治疗,虽然此时患者处于完全缓解期,但其转录水平拷贝数仍有730。3个月后患者出现复发,转录本水平升至为11000拷贝。经过ATRA+化疗治疗后转录本水平又逐渐下降至1200拷贝。结论;建立的实时定量RT-PCR灵敏、重复性好。治疗后APL患者的PML-RARa融合基因转录本水平明显下降,复发时基因转录本水平又升高。融合基因表达水平的改变与临床疾病进展关系一致,这有助于监测白血病微小残留病,评价疗效及判断预后。

三氧化二砷及全反式维甲酸对白血病NB4细胞PML/RARA融合基因的影响

目的探讨在NB4细胞增殖过程中PML/RARA融合基因表达的情况,并用三氧化二砷(As2O3)和/或全反式维甲酸(All trans retinoic acid,ATRA)干扰后观察目的基因的变化。方法用As2O3(1×106 mol/L)或/和ATRA(1×106 mol/L)干扰体外培养成熟的NB4细胞,后用real/Time PCR检测PML/RARA融合基因的相对表达量。结果ATRA及As2O3均使PML/RARA融合基因表达抑制,但双药联用无明显协同作用(P<0.05)。As2O3对PML/RARA融合基因表达抑制较同剂量ATRA强。结论 ATRA及As2O3均能下调PML/RARA融合基因。As2O3对PML/RARA融合基因的下调作用及对NB4细胞的增殖抑制均比同剂量的ATRA强。双药联用与单药干预,无叠加效应。

荧光原位杂交技术检测PML/RARa融合基因在儿童APL微小残留病中的应用

目的应用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)定量检测儿童急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocyticleukemia,APL)PML/RARa融合基因,监测患儿微小残留白血病(minimal residual disease,MRD)。方法对初发、诱导缓解、巩固、维持治疗中的30例APL患儿进行常规形态学检查、流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测及利用FISH进行PML/RARa融合基因定量检测。结果 30例初发骨髓细胞形态学及流式细胞术诊断为APL患儿,诱导化疗结束后骨髓细胞形态学均完全缓解,FCM检测MRD阳性19例,阴性11例,但FISH检测PML/RARa融合基因阳性27例,阴性3例。经巩固治疗后细胞形态学完全缓解,FCM检测MRD阴性29例,1例持续阳性最终复发;而FISH检测有7例PML/RARa融合基因检查仍呈阳性,其中3例在第一轮维持治疗后转阴,4例仍呈阳性,经IA方案化疗后,1例转阴,3例持续阳性者最终复发。两种检测方法阳性数比较差异有统计学意义(P<0.005)。结论FISH检测PML/RARa融合基因较FCM具有更高的敏感度,可以定量检测MRD,为早期预测复发,指导临床治疗提供依据。

应用FISH、FCM检测APL PML/RARA融合基因及临床应用的研究

目的 研究应用荧光原位杂交技术 (FISH)、流式细胞技术 (FCM)检测急性早幼粒细胞白血病 (APL)PML/RARa融合基因及残留白血病细胞的意义。方法 应用CG、M -FISH、FCM对 30例APL患者初发和缓解期的骨髓标本进行分析 ,分别检测t(15 ;17)易位和PML/RARa融合基因及残留白血病细胞的存在。结果 对初发期骨髓标本进行CG和FISH分析发现 ,10 0 %具有t(15 ;17)易位 ,阳性核型占 6 8%～ 10 0 % ,其中有 8例还伴有其他异常 ;10 0 %具有PML/RARa融合基因 ,且阳性中期相的比例高达 96 %～ 10 0 % ;结果具有显著差异 (P <0 0 0 1)。对CR期的骨髓标本进行CG、FISH分析 ,CG为正常核型 ,FISH仍可检出 0 %～ 4 5 %的PML/RARa融合基因。对CR后 12个月的标本进行CG、FISH分析 ,CG均为正常核型 ;FISH仍可检出 0 %～ 37%的PML/RARa融合基因 ,较CR期有所降低。对这 30例APL患者初发期、完全缓解期及完全缓解后 12个月时进行了FCM检测 ,并得出定性结果。完全缓解期检测结果与M -FISH分析一致 ;对完全缓解后 12个月时M -FISH结果进行定性分析发现 30例患者中有 6例为融合基因阴性 ,相应的FCM定性分析结果却发现只有其中的 2例呈现阴性 ,其余 4例仍然为阳性。随访至CR后 2年 ,发现 7例PML/RARa融合基因阳性中期相比例较高

FISH技术在PML/RARA融合基因检测中的应用体会

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)的一种特殊类型(M3),其临床特点是出血倾向严重,常易并发弥散性血管内凝血及原发性纤溶亢进,早期病死率高,所以APL的早期诊断和及早治疗至关重要。现已明确t(15;17)是APL的特征性染色体异常,并在分子水平上导致PML/RARA融合基因的形成[1]。对APL患者进行PML/RARA融合基因的检测具有重要的临床价值,可为患者的诊断、疗效和预后提供有效帮助。采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术对PML/RARA融合基因进行检测,具有成功率高、准确、省时,对检测标本限制低等优点[2]。因此,如何确保FISH的制片质量显得尤为重要。本科室经实践总结经验,对一些操作细节进行了改进,效果显著,现介绍如下。

发夹结构DNA探针用于检测白血病PML/RARA融合基因的电化学传感器的研究

基于急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）中PML／RARA（promyelocytic leukemia／retinoic acid receptor alpha）融合基因的碱基序列，设计了一种新型发夹结构DNA电化学探针，并将此探针固定在玻碳电极表面，采用自行合成的硝基吖啶酮（NAD）作杂交指示剂，应用循环伏安法与差分脉冲伏安法实现了对人工合成的APLPML／RARA融合基因的检测，同时对检测条件进行优化。结果表明，在pH7．0Tris—HCl缓冲液中，杂交前后NAD氧化峰电流差值与靶标链浓度在2．0×10^-8～1．0×10^-7mol·L^-1范围内呈良好的线性关系，检出限为3．0×10^-9mol·L^-1。

Bcr/ab1及PML/RARa融合基因在白血病中的表达与临床意义

目的探讨Bcr/ab1与PML/RARa融合基因在急性早幼粒白血病中的表达以及临床应用价值。方法我院2010年3月—2014年2月收治的急性早幼粒白血病病例中,根据患者诊断与治疗情况随机选取260例。初诊组80例,缓解组180例,均行巢式聚合酶链法检测Bcr/ab1与PML/RARa融合基因阳性情况。结果初诊组Bcr/ab1融合基因阳性率为72.5%,显著高于缓解组的1.1%;初诊组PML/RARa融合基因阳性率为60%,显著高于缓解组的1.1%,组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)。结论两种基因不仅在诊断急性早细粒白血病方面具有一定的指导意义,而且在临床治疗效果和患者病情转归评估方面也具有一定的参考价值。

PML/RARa阴性伴复杂核型染色体改变的急性早幼粒细胞白血病(APL)一例

急性早幼粒细胞白血病(APL)是急性白血病的一种特殊类型。全反式维甲酸(ATRA)、三氧化二砷相继应用于APL的治疗,使其成为急性髓系白血病中治愈率最高的一个亚型;而PML/RARa阴性伴复杂核型染色体改变的急性髓系白血病M3型则属于高危预后。

1例急性髓系白血病治疗缓解后继发急性早幼粒细胞白血病的诊断与治疗

目的总结1例RUNX1::RUNX1T1阳性急性髓系白血病(AML)治疗缓解后继发PML::RARA阳性急性早幼粒细胞白血病(APL)患者的诊治方法。方法回顾性分析1例RUNX1::RUNX1T1阳性AML治疗缓解后继发PML::RARA阳性APL患者的临床资料,并复习相关文献。结果患者中年男性,因全血细胞减少就诊。髓系白血病融合基因筛查示RUNX1::RUNX1T1阳性,明确诊断为RUNX1::RUNX1T1阳性AML。患者经过诱导缓解和巩固治疗后RUNX1::RUNX1T1转阴,缓解期大于2年,疾病复发时髓系白血病融合基因筛查示PML::RARA阳性,诊断为PML::RARA阳性APL,经37 d三氧化二砷联合维甲酸诱导分化治疗达到骨髓象缓解。结论RUNX1::RUNX1T1阳性AML患者缓解后发生继发性APL临床罕见,容易漏诊,确诊主要依靠髓系白血病融合基因筛查;其发病原因可能与药物毒性诱导克隆改变有关,采用三氧化二砷及维甲酸治疗效果较好。

急性早幼粒细胞白血病染色体易位联合R显带和间期荧光原位杂交技术分析

目的探讨荧光原位杂交(FISH)及常规细胞遗传学染色体核型分析技术对急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML/RARa融合基因检测的灵敏度和特异度及其在临床中应用价值。方法选取51例APL患者,应用常规细胞遗传学染色体核型分析方法及FISH技术检测患者PML/RARa融合基因的表达情况。结果在进行常规染色体核型分析的51例患者中41例(80.4%)为t(15;17)(q22;q21)易位的核型异常,其中38例(74.5%)为单纯t(15;17)(q22;q21)易位的核型异常,3例(5.9%)为伴t(15;17)(q22;q21)易位的复杂核型异常;10例(19.6%)无t(15;17)(q22;q21)易位的核型异常中1例(2.0%)为不伴t(15;17)(q22;q21)易位的复杂核型异常,1例(2.0%)为t(11;17)(q13;q21)易位的核型异常,3例(5.9%)为正常核型,5例(9.8%)未见分裂相。在进行FISH检测的51例患者标本中48例(94.1%)有PML/RARa融合基因异常,同时进行常规染色体核型分析和FISH检测的41例患者同时存在t(15;17)(q22;q21)易位的核型异常和PML/RARa融合基因异常,两者符合率为100%;在15例正常骨髓标本的FISH检测中15例标本结果均未发现有PML/RARa融合基因,提示FISH检测技术具有较高的敏感度和特异性。结论对于初发的APL患者,常规染色体核型分析和间期荧光杂交技术结合分析APL患者细胞遗传学特征是诊断该病的有力工具,FISH技术操作更为简单,省时直观。

三氧化二砷治疗难治复发急性早幼粒细胞白血病的分子生物学疗效观察

目的:观察三氧化二砷(AS_2O_3)治疗难治复发急性早幼粒细胞白血病(APL)的分子生物学疗效。方法:0.1%AS_2O_3注射液静脉滴注,连续28天为一疗程,并动态检测PML-RARa融合基因。结果:15例患者再次分子学完全缓解(CR)13例,CR率为86.7%,随访中2例再次出现PML-RARa融合基因阳性,给予AS_2O_3获得再次CR。结论:AS_2O_3诱导治疗难治复发APL患者分子生物学缓解率高,与化疗交替使用能进一步清除微小残留病。

染色体R显带分析、双色荧光原位杂交及实时荧光定量PCR对于急性早幼粒细胞性白血病诊断价值的评价

目的:评价染色体R显带技术(RT)、双色荧光原位杂交(D-FISH)和荧光定量PCR(RT-PCR)对急性早幼粒细胞白血病(APL)的诊断价值。方法:采用三种方法分析340例疑诊为APL患者的细胞遗传学特征或PML/RARa融合基因,以MICM综合诊断作为APL的诊断"标准",并与三者联合检测比较,评价RT、D-FISH和RT-PCR三者的诊断价值。结果:对于APL的诊断,RT、D-FISH以及RT-PCR三者的敏感度分别为81.3%(78/96),95.0%(91/96)和96.9%(93/96),RT漏检18例,D-FISH的检测结果判断5例假阳性,2例假阴性,RT-PCR的检测结果存在4例假阳性,3例假阴性。三者联合检测的敏感度为99.97%,特异度为100%。结论:三种检测方法单独应用于APL的诊断均存在一定的弊端,三者联合运用有利于提高临床诊断率,同时减少误诊率和漏诊率。

L型PML-RARα融合基因不同剪接体对ATO作用敏感性的研究

急性早幼粒细胞白血病（APL）特征性标志是染色体t（15；17）（q22；q21）易位，并形成PML．RARa融合基因.本课题组前期研究发现，PML基因第5、6外显子存在选择性剪接，可形成E5（＋）E6（＋）（第5外显子和第6外显子均存在）、E5（-）E6（＋）（第5外显子缺失）、E5（-）E6（-）（第5外显子和第6外显子均缺失）三种不同的剪接转录本，E5（-）E6（-）剪接体表达量高的患者预后差，三种剪接体对全反式维甲酸（ATRA）表现出不同的敏感性，

伴stat5b—RAR仅阳性的急性早幼粒细胞白血病一例报告并文献复习

95％以上的急性早幼粒细胞白血病（APL）患者可检出PML—RARa融合基因，少数患者为其他异常基因。目前已发现7种PML-RARct融合基因变异型，RARer的伴侣基因包括PLZF、NPM1、NUMA1、stat5b、PRKAR1A、FIPlLl及BCOR。其中stat5b—RARc少见，目前国内外仅报道8例。我们收治1例stat5b-RARa阳性的APL患者，报告如下并进行文献复习。