肺部结节或肿块患者肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化在肺癌诊断中的价值

目的通过肺组织活检或手术后病检结果来验证两基因甲基化指标检验肺部良、恶性结节诊断效能。方法进行前瞻性研究,收集2019年3月至2020年3月在云南省第三人民医院99例诊断为肺部结节、肿块的患者,行支气管镜检查收集支气管肺泡灌洗液(BALF)样本后,进行定期随访、肺穿刺活检、手术后病检。结果收集的99例肺部结节、肿块患者,经病理诊断后分为肺癌组(n=50)和良性肺疾病组(n=49)。肺癌组年龄(62.64±9.71)岁,良性肺疾病组年龄(60.48±13.69)岁,2组指标差异具有统计学意义(P=0.032);在肺癌的诊断过程中,发现SHOX2和RASSF1A基因任一阳性诊断肺癌的灵敏度分别为72%和58%,特异度分别为92.3%和95.9%。而这2个基因的联合检测在肺癌的诊断中表现出了更高的灵敏度,为0.84,远高于良性疾病组的0.102(P<0.001)。ROC曲线分析显示2个基因甲基化联合时灵敏度可提高至84%。结论肺泡灌洗液SHOX2和RASS1A基因甲基化检验对存在肺部结节或肿块影像表现的肺癌患者诊断具有良好的预测价值,在影像学和组织学诊断不明时,SHOX2和RASSF1A联合检验可以作为肺癌早期诊断的一个重要补充工具。

血浆SHOX2/RASSF1A/PTGER4基因甲基化检测对肺结节的诊断价值

【目的】探究血浆SHOX2/RASSF1A/PTGER4基因甲基化检测对肺结节性质判定及诊断的价值。【方法】抽取静脉血8~10 ml进行血浆分离,分离后的血浆进行DNA的提取与制备,其中包括裂解、结合、洗涤、亚硫酸盐转化、脱洗等步骤。进行PCR检测,分别设置SHOX2、RASSF1A、PTGER4甲基化的阈值,检测游离DNA中基因甲基化状态。采用首创的P值(阳性指数,Positive Index)计算公式法分析样本检测数据,依据阳性判断值判定样本阳阴性。【结果】84例胸部CT提示肺结节的患者,进行血浆游离DNA甲基化检测,其中阳性和阴性分别有18例和66例,阳性与阴性结果与患者的性别、吸烟、结节大小、多发与否无关;与年龄、结节的密度及病理类型有关,差异有统计学意义(P < 0.05)。通过金标准病理诊断肺癌有8例,其中6例甲基化检测为阳性,阳性率为75%;恶性结节与良性结节的甲基化阳性指数数值分别为2.00 ± 1.38和1.10 ± 0.92,差异有统计学意义(P < 0.05)。SHOX2/RASSF1A/PTGER4基因甲基化诊断肺癌的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异度分别为0.754、75%和84.2%。SHOX2/RASSF1A/PTGER甲基化与病理诊断评定结果存在一致性,Kappa = 0.842。【结论】SHOX2/RASSF1A/PTGER4基因甲基化检测可以成为肺结节性质早期判断的一种可靠且灵敏的新型生物学标志物,为肺癌的早期诊治提供依据。

SHOX2和RASSF1A基因甲基化在消化道肿瘤诊断和预后预测中价值的研究进展

消化道肿瘤发病率较高,由于其早期诊断较为困难,导致患者预后较差,因此对高危人群的筛查、早期诊断和及时治疗尤为重要。近年来,表观遗传学在肿瘤发病机制中的作用受到了广泛关注并取得了突破性研究进展。促癌基因矮小同源盒基因2(SHOX2)和抑癌基因Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)甲基化作为生物标志物在消化道肿瘤诊断和预后预测中的敏感度和特异度较高,有较高的应用价值。该文就SHOX2和RASSF1A基因甲基化在消化道肿瘤诊断和预后预测中价值的研究进展作一综述。

RASSF1A在细胞自噬及凋亡中的功能

肿瘤抑制因子Ras相关结构域家族成员1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)是Ras超家族蛋白重要的下游效应因子,具有调控自噬及凋亡的作用。自噬及凋亡是影响机体生存发育的重要生命过程,其调节紊乱与肿瘤的发生发展密切相关。本文针对RASSF1A对自噬及凋亡的调节机制及其与肿瘤发生发展之间的关系展开综述,分析翻译后修饰对于RASSF1A调节自噬及凋亡过程中功能切换的作用,探讨自噬及凋亡在肿瘤发生中的调节作用,以期为RASSF1A启动子高甲基化型肿瘤的治疗提供新思路。

RASSF1A基因在肺癌中的作用分析

肺癌作为发病率最高的恶性肿瘤之一,严重影响患者的生活质量和生存时间。RASSF1A基因是最早发现的抑癌基因之一,研究人员对RASSF1A基因的结构和位置进行相关研究。作为肿瘤抑制因子,RASSF1A基因却在肺癌患者中经常因为甲基化而失活,RASSF1A基因的缺失通过各种途径促进了RAS基因诱导肿瘤发生。研究表明,RASSF1A基因甲基化水平与肺癌临床病理特征相关,可以用作肺癌的诊断手段之一。各项预后相关研究表明RASSF1A高甲基化与肺癌的预后密切相关,RASSF1A基因高甲基化与患者低生存率存在密切联系。本综述主要就RASSF1A基因与肺癌发生、发展和预后的关系展开讨论。

贲门腺癌中RASSF1A基因甲基化与cyclin D1表达的关系

目的:探讨贲门腺癌(gastric cardiac adenocarcinoma,GCA)中RASSF1A基因的甲基化状态及其与cyclinD1蛋白表达之间的相关性。方法:分别应用甲基化特异性PCR(mothylation-specific PCR,MSP)方法和免疫组织化学SP法检测贲门腺癌组织及相应癌旁组织的RASSF1A基因甲基化情况和cyclin D1蛋白表达情况。结果:92例贲门腺癌组织中有54例RASSF1A发生了甲基化,甲基化率为58.7%,显著高于癌旁正常组织(P<0.001)。Ⅲ期和Ⅳ期贲门腺癌患者中RASSF1A基因发生甲基化的比率显著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.05)。92例贲门腺癌组织中有72例(78.3%)cyclin D1蛋白表达阳性,与相应癌旁正常组织比较,cyclin D1在贲门癌组织中的表达显著升高(P<0.001);且随肿瘤分化程度的降低,cyclin D1的阳性表达率明显升高(P<0.05)。RASSF1A基因在贲门腺癌中的高甲基化与cyclinD1蛋白表达之间有明显的相关性(P<0.05)。结论:RASSF1A基因启动子区的高甲基化以及cyclin D1蛋白的过表达可能参与了贲门腺癌的发生发展过程。

支气管肺泡灌洗液中SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测对肺癌的诊断价值

目的:对疑诊肺癌患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中SHOX2、RASSF1A基因甲基化分析,评估两指标联合检测区分肺癌与肺良性疾病的诊断效能及联合细胞学使用对肺癌的诊断价值。方法:收集276例肺部疾病患者(肺癌组131例,肺部良性疾病组145例)的BALF样本,应用PCR法检测BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化,并将检测结果和Sanger测序法结果比较。结果:PCR和Sanger测序法一致性分析显示两种方法在检测SHOX2和RASSF1A基因甲基化具有良好的一致性(Kappa=0.978,95%CI=0.954~1.000)。SHOX2和RASSF1A基因甲基化联合检测在肺癌组的诊断灵敏度为0.840,高于良性疾病组(0.193)(P<0.001);肺癌组BALF中SHOX2、RASSF1A基因甲基化联合检测阳性率在小细胞肺癌和肺鳞癌中分别是100%和90.9%,高于肺腺癌(66.0%);SHOX2和RASSF1A基因甲基化联合检测阳性率在晚期肺癌高达89.3%,明显高于早期肺癌阳性检出率。ROC曲线分析显示当SHOX2、RASSF1A基因甲基化、细胞学三指标联合使用时进一步将诊断灵敏度提高至0.931。结论:对BALF中SHOX2、RASSF1A基因甲基化PCR检测在肺癌诊断中有良好的灵敏度;SHOX2、RASSF1A甲基化PCR检测与细胞学联合使用可显著提高肺癌诊断灵敏度,是肺癌病理学诊断的有效补充工具。

痰标本FHIT、P16、MGMT、RASSF1A、APC基因甲基化在肺癌诊断中的作用

目的探讨肺癌患者痰标本中FH IT、P16、MGMT、RASSF1A和APC等抑癌基因启动子异常甲基化及其联合检测在肺癌筛查及早期诊断中的价值。方法采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)法,检测47例肺癌组织及对应的痰标本FHIT、P16,MGMT、RASSF1A和APC基因启动子区甲基化状态。24例肺良性疾病患者痰标本作为对照。结果 47例肺癌组织标本中FHIT、P16、MGMT、RASSF1A、APC基因启动子区甲基化检出率分别为40.4%(19/47)、53.2%(25/47)、36.2%(17/47)、21.3%(10/47)和38.3%(18/47);对照的痰标本中五者甲基化检出率分别为38.3%(18/47)、48.9%(23/47)、36.2%(17/47)、17.0%(8/47)和29.8%(14/47),两组甲基化检出率存在着一致性[P>0.05;κ(0.8～1.0)]。24例肺良性病变痰标本中未检测到任何异常甲基化,与肺癌组比较差异有统计学意义(P<0.05)。五项指标联合检测可明显提高肺癌检测的灵敏度(80.9%)和特异度(100.0%)。FHIT和P16基因痰标本甲基化检出率与患者吸烟指数有相关性(P<0.05)。结论痰标本中多个肺癌相关基因甲基化联合检测有望成为肺癌筛查、早期诊断简便有效的指标。

MiR-181a靶向RASSF1A促进骨肉瘤细胞的生长和转移

目的:探讨miR-181a是否靶向调控抑癌基因RAS相关区域家族1A(Ras-association domain family 1,isoform A,RASSF1A),从而促进骨肉瘤细胞的生长和转移。方法:采用real-time PCR检测30例人骨肉瘤组织及其癌旁正常骨组织中miR-181a的表达,并分析miR-181a表达水平与骨肉瘤患者临床病理特征的相关性。在骨肉瘤细胞MG-63中瞬时转染miR-181a模拟物和miR-181a抑制剂,分别采用MTT和transwell检测miR-181a对骨肉瘤细胞生长和转移的作用。随后,预测并通过双荧光素酶报告基因验证miR-181a与RASSF1A基因3'-非编码区(3'-untranslated region,3'-UTR)的特异性结合作用。结果:与癌旁正常骨组织比较,miR-181a在骨肉瘤组织中高表达(P<0.001),但其表达水平与骨肉瘤患者的性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤病理分期等无明显相关性(P>0.05)。MTT及transwell结果显示过表达miR-181a促进了MG-63细胞生长、迁移和侵袭,显著高于阴性对照组(P<0.05);而抑制miR-181a的表达降低了MG-63细胞生长、迁移和侵袭,显著低于阴性对照组(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-181a可靶向结合RASSF1A基因3'-UTR,从而调控RASSF1A的表达。结论:miR-181a可特异性结合RASSF1A基因3'-UTR,下调RASSF1A基因的表达,从而促进人骨肉瘤细胞MG-63的生长和转移。

三氧化二砷对前列腺癌DU-145细胞RASSF1A基因的去甲基化作用

目的研究三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)对激素非依赖性前列腺癌DU145细胞的生长抑制作用及对RASSF1A基因去甲基化和蛋白表达的影响。方法应用MTT法检测不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、12.0、20.0μmol/L)的As2O3不同作用时间(24、48、72 h)对DU145细胞的生长抑制作用;应用甲基化特异性PCR(MSP)和West-ern blot检测As2O3对DU145细胞RASSF1A基因甲基化状态及蛋白表达的影响。结果 As2 O3可抑制DU145细胞的增殖,在一定范围内随着药物浓度的增高,抑制作用逐渐增强(F=838.089,P<0.05);同一浓度作用时间越长,抑制率越高(F=8.849,P<0.05);且As2O3可使RASSF1A基因甲基化逆转,蛋白重新表达。结论 As2O3可以逆转前列腺癌DU145细胞RASSF1A基因启动子CpG岛的异常甲基化,诱导该抑癌基因的重新表达,抑制前列腺癌DU145细胞的增殖。

诱导痰RASSF1A,p16和DAPK基因启动子区甲基化在肺癌诊断中的价值

目的:探讨诱导痰中RASSF1A,p16和DAPK基因启动子区异常甲基化及其联合检测在肺癌诊断中的价值。方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)技术,检测82例肺癌患者诱导痰和对应肿瘤组织以及25例肺部良性病变组织中RASSF1A,p16和DAPK3种基因启动子区甲基化改变,并分析三者与临床病理资料的关系。结果:肺癌病理组织中RASSF1A,p16和DAPK基因启动子区甲基化检出率分别为63.4%,59.8%和58.5%,对应的诱导痰三者甲基化检出率分别为54.9%,48.8%和51.2%;肺部良性病变组织中甲基化检出率均为零,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。RASSF1A基因甲基化检出率在中高分化和无淋巴结转移的肺癌中明显低于低分化和未分化及有淋巴结转移者(P<0.05),与年龄、性别、吸烟指数、临床分期及病理类型无关,而p16和DAPK基因甲基化检出率与上述因素均无明显相关性(P>0.05);联合检测3种基因甲基化的检出率为73.2%。结论:联合检测诱导痰中RASSF1A,p16和DAPK基因启动子区高甲基化有可能作为诊断肺癌及评估预后的简便有效的指标,并能提高检出率。

肺癌患者RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化检测

目的:探讨外周血RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化与肺癌发生发展的关系。方法:应用实时荧光定量甲基化特异PCR(qMSP)方法检测200例肺癌患者和200例健康对照人群外周血RASSF1A和FHIT基因启动子区的甲基化率,分析其在2组人群中甲基化水平的差异,并分析年龄、性别、吸烟史、组织学类型及临床分期对基因启动子区甲基化率的影响。结果:2组外周血RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化率的差异有统计学意义(RASSF1A:Z=2.075,P=0.038;FHIT:Z=3.044,P=0.002)。肺癌患者的性别、年龄和吸烟史、组织学类型及临床分期与RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化无关。随着RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化水平增加,患肺癌的危险性增加[RASSF1A:β=0.235,OR(95%CI)=1.551(1.023～2.353);FHIT:β=0.091,OR(95%CI)=1.763(1.116～2.671)]。结论:RASSF1A和FHIT基因启动子区的甲基化与肺癌有关,检测外周血中RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化水平可能有助于肺癌的早期预警。

喉鳞状细胞癌中RASSF1A基因启动子区甲基化及蛋白表达

目的:探讨RASSF1A基因启动子区甲基化与喉癌的关系。方法:运用甲基化特异性PCR,检测RASSF1A基因在48例喉癌组织、相对应癌旁组织及48例正常人外周血中的启动子区甲基化情况。用Westernblotting方法检测喉癌组织、癌旁组织及正常人外周血中RASSF1A表达情况。结果:在48例喉癌组织、相对应的癌旁组织和48份正常人外周血中,RASSF1A基因启动子区分别有34例(70.83%)、11例(22.92%)和6例(12.50%)发生了甲基化,喉癌组织甲基化程度明显高于癌旁组织和正常人外周血(P<0.05)。在48例喉癌组织中27例(56.25%)不能正常表达RASSF1A蛋白,而相对应癌旁组织中仅有8例(16.67%),喉癌组织中RASSF1A蛋白的表达程度明显低于癌旁组织(P<0.01)。启动子区发生甲基化的34例喉癌组织中共有25例(73.53%)呈弱阳性,而7例未发生甲基化的喉癌组织中为1例(14.29%),两组间比较差异具有显著性(P<0.05)。结论:RASSF1A基因启动子区甲基化与喉癌的发生有关,有望成为喉癌诊断的分子标志。

支气管肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测在临床肺癌早期诊断中的应用

目的综合评价支气管肺泡灌洗液(BALF)中基因矮小同源盒基因(SHOX)2、基因RAS类联域家族(RASSF)1A甲基化和4种血浆肿瘤标志物对早期肺癌的诊断价值。方法选取病理确诊的134例患者,其中67例早期肺癌纳入肺癌组,67例良性病变者纳入对照组。所有患者采用实时荧光PCR(RT-PCR)法检测BALF中基因SHOX2和RASSF1A甲基化情况,并收集癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)、鳞状细胞癌抗原(SCCAg)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)血浆肿瘤标志物结果。统计BALF基因SHOX2、RASSF1A及肿瘤标志物诊断肺癌的灵敏度和特异度。通过Logistic回归分析评价各指标对肺癌组织的影响。构建受试者工作特征(ROC)曲线,计算各指标曲线下面积(AUC)值,以评估其在早期肺癌诊断中的性能。结果基因SHOX2及RASSF1A甲基化诊断灵敏度分别为80.6%、79.1%,特异度为82.1%、85.1%。Logistic回归分析显示,Cyfra21-1、NSE、SHOX2ΔΔCT及RASSF1AΔΔCT值是肺癌的影响因素。以基因SHOX2ΔΔCT值联合基因RASSF1AΔΔCT值为检验变量,绘制ROC曲线,诊断肺癌的AUC值为0.935,显著高于单独进行SHOX2和RASSF1A、NSE和Cyfra21-1诊断肺癌的ROC曲线(P<0.05)。结论BALF的基因SHOX2及基因RASSF1A甲基化,对早期肺癌的诊断有较高的敏感性和特异性,对肺癌的早期诊断具有高效的诊断能力,联合SHOX2、RASSF1FΔΔCT值诊断效率显著升高,在早期肺癌诊断中可以作为细胞学的辅助工具。

RASSF1A在食管鳞癌组织中的表达、甲基化状态及其与预后之间的关系

目的:探讨RASSF1A基因的异常表达与食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)发生发展的关系.方法:应用实时RT-PCR方法及实时荧光甲基化特异性聚合酶链反应技术,分别检测49例ESCC患者癌组织及癌旁正常组织中RASSF1A基因的转录表达情况和启动子区域5'-CpG岛的甲基化状态.分析RASSF1A基因在ESCC中的转录表达情况、甲基化状态及与临床病理因素、预后之间的关系.结果:在49例ESCC标本中,有26(53.06%)例RASSF1A mRNA表达下调,RASSF1A mRNA在食管鳞癌组织及相应的癌旁正常组织中的表达存在显著统计学差异(P<0.05),RASSF1A mRNA的表达缺失与ESCC患者的淋巴结转移、临床TNM分期及不良预后均存在显著相关性(均P<0.05);有38(77.60%)例RASSF1A基因启动子区域5'-CpG岛高甲基化,与之相对应的癌旁正常组织中仅有3(6.10%)例,两者差异有统计学意义(P<0.05),RASSF1A基因的高甲基化状态与淋巴结转移、临床TNM分期及不良预后均存在显著相关性(均P<0.05);在26例RASSF1A基因转录表达缺失的ESCC组织中有24例发生了启动子区域5'-CpG岛的高甲基化,RASSF1A基因在ESCC中的转录表达缺失与其启动子5'-CpG岛高甲基化显著相关(P<0.05).结论:RASSF1A基因启动子5'-CpG岛高甲基化在ESCC是一高频分子事件,与该基因的转录表达缺失显著相关,是其转录表达缺失的主要机制之一.

GSTP1和RASSF1A基因多态性和环境因素与前列腺癌的相关性分析

目的探讨GSTP1和RASSF1A基因多态性及环境因素和前列腺癌易感性之间的关系。方法采用TaqMan/MGB探针基因分型方法对103例前列腺癌患者和103例正常对照的中国汉族人群基因组DNA进行GSTP1和RASSF1A基因多态性检测,并结合环境因素应用多因素Logistic回归分析吸烟、饮酒、饮茶、猪肉和牛肉每周实际摄入量及各位点基因型与前列腺癌易感性之间的关系。结果GSTP1基因型AA、AG、GG在前列腺癌和对照人群中的比例分别为66.02%、22.33%、11.65%和67.96%、29.13%、2.91%,有统计学差异(χ2=6.35,P=0.04);RASSF1A基因型CC、CA、AA在前列腺癌和对照人群中的比例分别为88.34%,5.83%,5.83%和85.44%,12.62%,1.94%,无统计学差异(χ2=4.63,P=0.10)。多因素Logistic回归分析显示,饮茶者患前列腺癌的危险性是不饮茶者的0.40倍(95%CI,0.19～0.82),吸烟者患前列腺癌的危险性是不吸烟者的3.02倍(95%CI,1.44～6.32)。结论GSTP1和RASSF1A的基因多态性和中国汉族人群前列腺癌的发生无相关性;吸烟是前列腺癌的危险因素,饮茶是保护因素。

原发性肝癌中RASSF1A基因表达失活及其临床意义

目的研究肝癌组织中的抑癌基因RASSF1A的表达情况和由于启动区异常甲基化导致其基因外失活的状况,并分析DNA异常甲基化与肝癌临床相关因素之间的关系。方法利用RT-PCR和MS-PCR的方法,结合DNA测序和TaqⅠ酶切消化法,分析24例肝癌标本、4株肝癌细胞株中RASSF1A基因的表达情况,以及其基因启动区异常甲基化的情况。采用甲基化抑制剂5′-Aza-CdR处理肝癌细胞株,观察RASSF1A重新表达的情况。结果66·7%的肝癌组织未表达RASSF1A;4株肝癌细胞株中仅1株检测到RASSF1A的表达。83·3%的肝癌组织及4株肝癌细胞株都发生了异常甲基化,而正常肝组织和正常肝细胞株(L02)中却未发现甲基化。甲基化与肝硬化、乙肝表面抗原、肿瘤分化程度及血管浸润和远处转移有相关性。原来RASSF1A表达失活的3株肝癌细胞株经甲基化抑制剂5′-Aza-CdR处理后,又重新恢复了表达。结论基因转录启动区的异常甲基化是导致肝癌中RASSF1A表达失活的主要原因。检测RASSF1A启动区异常甲基化可作为一种有潜在应用价值的生物分子指标来用于肝癌的早期发现、早期诊断以及预后的判断。

RASSF1A基因在宫颈癌中的甲基化检测及

目的 探讨宫颈癌组织中RASSF1A(Ras association domain family1A)抑癌基因启动子甲基化状态及临床意义以及与高危型HPVs感染的关系。方法 甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法检测39例宫颈鳞癌及12例正常宫颈组织中RASSF1A基因甲基化状态。聚合酶链反应(PCR)方法检测宫颈癌组织中HPV16、18型的感染状况。结果 39 例宫颈癌组织中有11 例可见异常甲基化(28.2%);12例正常宫颈组织均未见甲基化;宫颈癌组HPV感染率为69.2%;RASSF1A基因甲基化在淋巴结转移组(75.0%)高于淋巴结未转移组(9.1 %),P<0.05。RASSF1A甲基化在患者年龄、肿瘤大小、病理组织学分级、临床分期和HPVs感染组之间差异无统计学意义, P>0.05。结论 RASSF1A基因启动子区5′CpG岛的高甲基化是导致RASSF1A基因失活的重要机制,可能参与宫颈癌的发生过程。

实时荧光定量检测人血浆中RASSF1A基因启动子甲基化

目的建立检测人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化的方法。方法以肺癌细胞株NCI-H460作为RASSF1A基因启动子区甲基化阳性样本,传统酚/氯仿法提取细胞DNA,经紫外分光光度计定量后以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200μl健康人血浆中,制备得到模拟肺癌患者血浆。用磁珠法从模拟血浆样本和15例早期肺癌患者血浆中提取总DNA。对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以TaqMan技术的实时荧光定量甲基化特异性PCR(MSP)进行检测。以模拟血浆样品作为标准品,用外标准曲线法对肺癌患者血浆中的甲基化RASSF1A进行定量。结果实时荧光定量MSP对模拟肺癌患者血浆的检测最低限为150拷贝(甲基化的肿瘤DNA)/ml(血浆)。15例肺癌患者5例RASSF1A甲基化阳性(33.3%)。5例肺癌患者血浆中甲基化的RASSF1A基因的浓度分别为2.56×103,8.20×104,1.45×104,3.31×104和4.24×104拷贝/ml。结论实时荧光定量MSP法检测肺癌患者血浆DNA中RASSF1A基因甲基化,灵敏度高,特异性强。

孕妇血浆中胎源性RASSF1A基因在无损性产前诊断中的应用研究

本研究旨在探讨运用非性别依赖的甲基化表观遗传学标记RASSF1A基因作为孕妇血浆中循环游离胎儿DNA存在的通用性标志的可行性。采用2种方法提取孕妇血浆游离DNA,选用其中效果较好的用磁珠法提取20例标本的游离DNA;采用RT-PCR方法扩增SRY基因以及甲基化酶处理后的RASSF1A基因,且对酶处理后RASSF1A基因的扩增体系进行条件优化。结果表明,在20例标本中11例检测有SRY基因,且与胎儿出生后性别相符;选用优化后的PCR体系扩增甲基化酶处理后的RASSF1A基因,在18例标本中检测有RASSF1A基因,在2例标本中未检测到此基因。结论:甲基化RASSF1A基因与SRY基因相比,不受胎儿性别限制,可作为广泛性胎儿特异性表观遗传学标记物,用于临床无损性产前诊断。