竹节参齐墩果烷皂苷对RAW264-7巨噬细胞SIRT1活性影响及抗炎作用研究

目的探讨竹节参齐墩果烷皂苷(chikusetsu oleanane saponin,COS)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激RAW264.7巨噬细胞的SIRT1活性影响及抗炎作用。方法Griess法测定一氧化氮(NO)释放量;免疫印迹(Western blot)法检测炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)蛋白表达;免疫荧光分析COS对细胞核因子-κB(NF-κB)和沉默信息调节因子1(silent information regulator1,SIRT1)核转运的作用。结果 COS在25~300 mg·L^(-1)与1 mg·L^(-1)LPS共培养时,对RAW264.7细胞生长无明显影响;与LPS组相比,COS能有效抑制NO释放和抑制TNF-α、IL-1β的分泌;还能抑制NF-κB的核移位,上调SIRT1的表达。结论 COS对LPS刺激的RAW264.7细胞炎症具有保护作用,其保护机制可能是COS上调SIRT1表达,促进NF-κB去乙酰化作用,从而抑制NF-κB的核移位,减少TNF-α、IL-1β等炎症因子的产生。

生姜油树脂对过氧化氢引起RAW264.7巨噬细胞损伤的保护作用

目的:研究生姜油树脂对过氧化氢引起的RAW264.7巨噬细胞损伤的影响。方法:以生姜油树脂为研究对象,建立RAW264.7细胞的过氧化氢损伤模型,测定质量浓度分别为1、3、5μg/mL的生姜油树脂联合过氧化氢对RAW264.7细胞和细胞培养液中丙二醛、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化指标的影响。结果:生姜油树脂各剂量组均能显著缓解过氧化氢引起的RAW264.7细胞的损伤,降低细胞及细胞培养液内的丙二醛含量,提高谷胱甘肽含量以及超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,其中5μg/mL生姜油树脂对过氧化氢引起的细胞损伤的保护作用效果最好。结论:生姜油树脂对过氧化氢引起的RAW264.7细胞损伤具有保护作用,其作用机制可能是生姜油树脂通过调节细胞氧化还原系统,提高抗氧化能力,有效清除自由基的产生,从而对细胞的氧化性损伤起保护作用。

夏枯草总三萜对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响

目的探讨夏枯草总三萜(TTP)对细菌脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞分泌炎症因子的调节及对Jak/Stat通路的影响。方法培养RAW264.7细胞系,体外用LPS(2μg/ml)刺激,ELISA法检测不同质量浓度的TTP(12.5、25、50、100、200μg/ml)分别作用24、48、72 h后对细胞分泌前列腺素E2(PGE2)的影响,选取质量浓度为25、50、100μg/ml的TTP,进一步用RT-PCR法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、Jak2和Stat3 mRNA的表达,ELISA法检测细胞上清中TNF-α、IL-6蛋白的表达。结果 TTP可以抑制细胞分泌PGE2,并且呈浓度和时间依赖性(P<0.05,P<0.01),TTP可以抑制LPS刺激的RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6(P<0.01),并且明显抑制Jak2、Stat3的基因表达(P<0.01)。结论 TTP可以抑制RAW264.7细胞分泌炎症因子,调节细胞炎症因子网络的平衡,具有一定的抗炎作用,且这一作用的产生可能与Jak/Stat通路有关。

毛蕊花糖对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用

目的:明确毛蕊花糖对巨噬细胞RAW264.7免疫功能的调节作用。方法:分别以质量浓度25、50、100、200、400μg/mL的毛蕊花糖对RAW264.7巨噬细胞进行培养,以10μg/mL的脂多糖(LPS)为阳性对照组、不加任何样品的培养基为空白对照组。通过噻唑蓝(MTT)实验、吞噬中性红实验、NO释放量测定及酶联免疫吸附法测定细胞因子(IL-6、IL-1β、IFN-α、IFN-γ)的分泌量,评价毛蕊花糖的免疫调节作用。结果:质量浓度为25～400μg/mL的毛蕊花糖对巨噬细胞RAW264.7作用24h后,可显著提高巨噬细胞的增殖活性、吞噬活性、NO释放量以及细胞因子的分泌水平,并且毛蕊花糖溶液质量浓度为200μg/mL时效果最好。结论:毛蕊花糖对小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7具有免疫调节活性,是一种良好的免疫增强剂。

JAK2/STAT3信号通路对RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响

目的探讨JAK2/SATA3信号通路对核因子kB受体活化因子配体(Receptor activator of NF-κB Ligand,RANKL)诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程的影响。方法用ATP竞争性JAK2激酶抑制剂AG490与RANKL同时处理RAW264.7细胞,倒置显微镜观察细胞形态的变化,抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant AcidPhosphatase,TRAP)染色法观察TRAP阳性破骨细胞形态并计数,采用反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测不同诱导条件下RAW264.7中破骨细胞标志分子TRAP、RANK(Receptoractivator of NF-κB)、巨噬细胞标志分子CD11b和Emr1及转录因子活化T细胞核因子(Nuclear Factor of Activated Tcells c1,NFATc1)的mRNA表达情况,细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit,CCK8)法检测AG490对RAW264.7细胞增殖的影响,同时应用Western blot法检测STAT3磷酸化情况。结果 ATP竞争性JAK2激酶抑制剂AG490可显著抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞的分化,其作用机制主要是通过下调Ser727-STAT3磷酸化水平抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞增殖、进而导致NFATc1转录因子表达水平下降有关。结论 JAK2/STAT3是破骨细胞前体细胞分化成熟过程中的关键信号通路,以此为靶向的特异性抑制剂AG490对于治疗以破骨细胞过度活化为主要特性的疾病具有潜在的应用前景。

RANKL诱导小鼠单核细胞RAW264．7分化成成熟破骨细胞

目的观察小鼠的单核／巨噬细胞RAW264．7的一般生物学特征及在RANKL诱导下形成成熟破骨细胞的特征。方法 RANKL诱导RAW264．7细胞6d后,用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) 染色法观察TRAP阳性多核细胞,吖啶橙染色激光共聚焦显微镜(LCSM)观察多核细胞形态;诱导RAW264．7细胞9d后,RT-PCR检测RAW264．7细胞的破骨细胞表型和功能基因表达及其 RANKL诱导后变化;诱导RAW264．7细胞12d后,钙磷覆盖的破骨细胞活性分析板观察破骨细胞的骨吸收功能。结果 RAW264．7细胞TRAP染色阴性,单核或2个核,能表达破骨细胞表型和功能基因,无骨吸收功能。RANKL可诱导RAW264．7细胞形成TRAP阳性成熟的多核破骨细胞, 上调CathepsinK、CAⅡ、integrinβ3等基因。mRNA的表达。结论 RAW264．7具有破骨细胞特征性基因表达谱,是一种较好的破骨前体细胞模型。RANKL可诱导RAW264．7细胞形成成熟破骨细胞。

巴马汀对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6表达的影响

目的:观察巴马汀对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7小鼠巨噬细白介素6(IL-6)表达的作用.方法:采用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立细胞炎症反应模型,加入不同浓度的巴马汀,采用ELISA法检测IL-6的生成量;采用qRT-PCR法检测IL-6 mRNA的表达.结果:巴马汀能明显抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6的生成,以及IL-6mRNA的表达,并呈现出浓度依赖性.结论:巴马汀可通过抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6的生成及IL-6mRNA的表达,从而发挥抗炎作用.

β-胡萝卜素对脂多糖刺激巨噬细胞RAW264.7炎症因子的影响及其机制

目的:探讨β-胡萝卜素对脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞RAW264.7炎症因子的影响及其机制。方法:采用5μg/ml的LPS刺激巨噬细胞24 h后用不同浓度的β-胡萝卜素(20、40、80、160μmol/L)处理细胞3 h,MTT法测细胞活性,荧光定量PCR测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA相对表达量,ELISA测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌量,Western blot测NF-κB p65蛋白相对表达量。5μg/ml的LPS和不同浓度的NF-κB抑制剂PDTC(1、5、10μg/ml)共同处理巨噬细胞24 h,Western blot测NF-κB p65蛋白相对表达量,荧光定量PCR、ELISA测炎症因子的表达和分泌。比较LPS+PDTC组和LPS+PDTC+β-胡萝卜素组炎症因子和NF-κB p65蛋白相对表达的变化。结果:与LPS组相比,不同浓度的β-胡萝卜素对LPS刺激的巨噬细胞的细胞活性有提升作用,对炎症因子和NF-κB p65蛋白的表达有抑制作用;抑制NF-κB蛋白的表达可以抑制LPS刺激的巨噬细胞炎症因子的分泌;LPS+PDTC+β-胡萝卜素组对炎症因子的抑制作用比LPS+PDTC组明显,且差异显著(P<0.05),但两组对NF-κB p65蛋白的表达不明显。结论:β-胡萝卜素可以通过抑制NF-κB通路中NF-κB p65蛋白的表达抑制LPS刺激的巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌,且此通路不是唯一相关的通路。

干扰NaV1.9对RAW264.7细胞增殖、吞噬和迁移的影响

目的应用RNA干扰技术沉默RAW264.7小鼠巨噬细胞中电压门控性钠通道(VGSCs/NaVs)α亚单位NaV1.9基因,建立稳定干扰细胞株,并观察其对细胞增殖活性、吞噬能力和迁移功能的影响。方法通过LipofectamineTM2000将短发夹RNA(shRNA)干扰质粒转染至RAW264.7细胞,经G418筛选获得稳定细胞株。用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定干扰效率,CCK-8法测定稳定细胞株的增殖活性,流式细胞术检测细胞的细胞周期及吞噬能力,Transwell小室法检测细胞的迁移功能。结果成功建立稳定干扰NaV1.9的细胞株,RT-PCR法鉴定干扰效率达80%。CCK-8法及流式细胞术结果显示,降低NaV1.9的表达使细胞增殖活性下降(P<0.05);流式细胞术结果显示,抑制NaV1.9的表达使细胞吞噬能力降低(P<0.05);Transwell小室法结果显示,干扰NaV1.9的表达使细胞迁移能力减弱(P<0.05)。结论建立了稳定干扰NaV1.9的RAW264.7细胞株,下调NaV1.9的表达使巨噬细胞增殖活性、吞噬能力和迁移功能显著降低。

Wnt/β-catenin信号途径抑制Raw264.7分化

目的了解Wnt/β-catenin信号途径对小鼠单核/巨噬细胞Raw264.7的分化调控。方法将细胞分为4组:阴性对照组(即空Raw264.7组)、实验对照组(即感染Ad-GFP组)、阳性对照组(即50 ng/mL RANKL诱导组)和实验组(即感染Ad-β-catenin组)。分别给予上述4组处理因素后常规细胞培养3、6和9 d提取细胞总RNA,荧光定量real-time(RT-PCR)检测核因子受体(RANK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(Cathepsin K)及金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA的表达,再于同样处理因素培养6 d通过酒石酸抗酸性磷酸酶(TRAP)染色观察Raw264.7的分化情况;Western blot检测TRAP、Cathepsin K蛋白的表达。结果 RT-PCR检测Ad-β-catenin组能下调RANK、TRAP、Cathepsin K和MMP-9 mRNA的表达;TRAP染色显示50 ng/mL RANKL诱导组能成功诱导Raw264.7成多核细胞,空白组和Ad-GFP组有个别多核细胞,Ad-β-catenin组为单核细胞;Westernblot检测显示Ad-β-catenin组TRAP、Cathepsin K蛋白表达降低(P<0.05)。结论 Wnt/β-catenin信号途径能抑制RAW264.7分化成熟为破骨细胞。

IL-6对RAW264.7细胞成熟分化的体外实验研究

目的探讨研究白介素-6(Interleukin-6,IL-6)对核因子NF-κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclear kappa B ligand,RANKL)及对破骨前体细胞的成熟分化和溶骨效应。方法破骨前体细胞RAW264.7细胞经50ng/mL RANKL诱导1 d后将其分为:1、空白对照组(RANKL+PBS)2、低浓度IL-6组(RANKL+50ng/mL IL-6)3、中浓度IL-6组(RANKL+100ng/mL IL-6)4、高浓度IL-6组(RANKL+150ng/mL IL-6)。连续培养9 d后,进行HE染色检测成熟破骨细胞生成量;通过抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)染色法观察TRAP阳性多核细胞的情况;运用扫描电镜检测破骨细胞在骨片上的骨吸收陷窝形成情况。结果 HE染色中,成熟破骨细胞生成量中、高浓度IL-6组明显少于低浓度IL-6组(P<0.05),低浓度IL-6组和空白对照组间无明显差别(P>0.05)。②通过TRAP染色后,经染色阳性区域面积与视野面积的百分比计算,中、高浓度IL-6组与明显少于低浓度和空白对照组(P<0.05)。③扫描电镜观察发现骨吸收陷窝面积与视野面积的百分比随着IL-6浓度的增高,相比空白对照组有显著减少,且高浓度IL-6组中陷窝形成最少(P<0.05)。结论 IL-6能直接作用于经RANKL诱导的RAW264.7细胞,能明显抑制破骨细胞激活分化,并降低破骨细胞所致的骨吸收效应。当IL-6浓度超过50ng/mL时,其抑制破骨细胞的骨吸收效应更加明显。

紫金龙氯仿-甲醇组分对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症的抑制作用

目的探讨紫金龙氯仿-甲醇组分对脂多糖诱导RAW264. 7细胞炎症的抑制作用。方法脂多糖刺激RAW264. 7细胞建立体外炎症模型后,加入不同质量浓度(50、100、200、400 mg/L)紫金龙氯仿-甲醇组分,ELISA法或比色法检测白介素-6 (IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)含有量,Western blot法测定诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、环氧化酶-2 (COX-2)蛋白表达,以及核转录因子κ转抑制蛋白α(IκBα)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)、c-Jun氨基端激酶(JNK)、细胞外调节蛋白激酶1/2(Erk1/2)磷酸化水平。结果紫金龙氯仿-甲醇组分可显著抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、NO、PGE2释放(P <0. 05,P <0. 01),下调i NOS、COX-2蛋白水平(P <0. 01),降低p38、JNK、Erk1/2、IκBα磷酸化水平(P <0. 05,P <0. 01)。结论紫金龙氯仿-甲醇组分可有效抑制脂多糖诱导RAW264. 7细胞炎症,其机制可能与抑制NF-κB、MAPKs信号通路激活、减少炎症因子释放有关。

实时荧光定量PCR检测RAW264.7巨噬细胞中Th1/Th2型细胞因子转录水平方法的建立及初步应用

目的建立小鼠RAW264.7巨噬细胞的Th1和Th2型细胞因子荧光定量PCR检测方法。方法依据GenBank中小鼠的β-actin基因序列、Th1型及Th2型细胞因子的核苷酸序列设计特异性引物,以RAW264.7巨噬细胞mRNA反转录后的cDNA为模板,通过构建质粒阳性标准品,建立检测上述细胞因子转录水平的real-time PCR方法。结果用建立的荧光定量PCR方法,检测牛型布鲁氏菌S2308株感染RAW264.7巨噬细胞后,巨噬细胞Th1和Th2型细胞因子的转录水平。最低检测量为102拷贝/μL,线性关系很好,R2≥0.982,该方法具有良好的特异性和重复性。结论成功建立了检测巨噬细胞中Th1和Th2型细胞因子转录水平的荧光定量PCR方法。

靛玉红、色胺酮对LPS诱导RAW264.7炎症细胞模型的抗炎作用研究

目的研究靛玉红、色胺酮对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7炎症细胞的抗炎作用。方法以10μg/ml LPS刺激RAW264.7细胞24 h诱导UC体外炎症模型,以MTT法检测靛玉红、色胺酮的对正常细胞的作用,以酶联免疫吸附法(ELISA)研究靛玉红、色胺酮在直接干预、预防干预2种模式下对细胞培养液白细胞介素-6(IL-6)/肿瘤坏死因子(TNF-α)浓度的影响。结果模型组中IL-6/TNF-α浓度较正常组均有明显升高(P<0.01);靛玉红直接干预时,细胞培养液IL-6(5.0、10.0μmol/L)/TNF-α(2.5、5.0、10.0μmol/L)均较模型组有明显下降(P<0.05);色胺酮直接干预时,细胞培养液IL-6(0.8、8.0μmol/L)/TNF-α(0.8μmol/L)均较模型组有明显下降(P<0.01,P<0.05),预防作用模式下,细胞培养液IL-6(0.08、0.8μmol/L)较模型组有明显下降(P<0.05)。结论靛玉红、色胺酮有一定的体外抗炎作用,抗炎模式以直接干预为主,抗炎机制可能为下调IL-6/TNF-α的表达,可用于防治溃疡性结肠炎。

脂多糖体外诱导RAW264.7细胞产生NF-κBp65、iNOS及TNF-α

目的 研究脂多糖诱导RAW264.7细胞产生NF-κBp65、 TNF-α及诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）的剂量、时间关系, 为抗炎药物的体外筛选提供实验依据。方法 调整RAW264.7细胞密度为1×109/L, 种6孔板, 实验设正常对照组、（1、2、5、10） μg/mL脂多糖组, 免疫细胞化学方法检测NF-κBp65、iNOS及TNF-α的水平。结果 （1、2、5、10） μg/mL脂多糖可显著诱导产生NF-κBp65（P〈0.05）, 2-10 μg/mL时可显著诱导iNOS的生成（P〈0.01）, 5-10 μg/mL时可显著诱导TNF-α的生成（P〈0.05）。结论 5-10 μg/mL脂多糖可同时诱导产生NF-κBp65、iNOS及TNF-α, 模型性能稳定, 可用于多细胞因子途径的抗炎药物筛选。

猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A经NF-κB/MAPK通路对巨噬细胞RAW264.7影响的研究

通过猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A(catabolite control protein A,ccpA)原核表达蛋白对巨噬细胞RAW264.7进行刺激,结果发现,猪链球菌2型ccpA蛋白可以调节巨噬细胞NO产生,另外该蛋白质可通过对iNOS、NF-κB、p38和ERK1/2MAPK等的调节,从而影响巨噬细胞RAW264.7对细胞因子IL-6、TNF-α和IFN-γ的分泌。该研究为类似蛋白质对免疫细胞NF-κB/MAPK等通路调节影响及细胞因子产生条件探索建立了基础。

卵黄高磷蛋白对RAW264.7生长及其吞饮作用的影响

经MTT法和中性红吞饮法研究了卵黄高磷蛋白(PVS)对RAW264.7细胞生长及其吞饮作用的影响。研究结果表明,在0-100μg/mL浓度范围内,PVS(或与LPS共培养)可促进RAW264.7细胞增殖,PVS可提高RAW264.7细胞吞饮中性红的能力,但与LPS共作用时,却几乎未能使细胞的吞饮能力发生改变;细胞形态显微观察结果表明PVS明显抑制LPS诱导的巨噬细胞的活化。以上两方面结果表明PVS对RAW264.7巨噬细胞吞饮能力的影响呈双向调节作用。

铁超载对小鼠单核细胞RAW264.7向破骨细胞分化的影响

目的探讨铁超载对小鼠单核细胞RAW264.7向成熟破骨细胞分化的影响。方法实验分为正常对照组、低铁对照组、高铁干预组3组,用含有核因子kB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的培养基诱导RAW264.7向破骨细胞分化,在此过程中加入去铁胺(DFO)和不同浓度的枸橼酸铁铵(FAC)。对培养第4天和第7天的细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,对TRAP阳性细胞进行计数,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养基中TRAP-5b的含量。结果 (1)高铁干预组的TRAP阳性细胞数高于正常对照组和低铁对照组(P<0.05),具有时间和浓度依赖性;(2)高铁干预组的TRAP-5b的含量高于正常对照组(P<0.05),具有浓度依赖性。结论铁超载能促进RAW264.7向破骨细胞分化。

鸢尾甲黄素A对脂多糖诱导小鼠RAW264.7细胞分泌炎性因子的调节作用

目的研究射干中鸢尾甲黄素A对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌炎性因子一氧化氮(NO)和白细胞介素6(IL-6)的调节作用。方法采用LPS诱导RAW264.7细胞,建立细胞炎性反应模型。用不同质量浓度的鸢尾甲黄素A进行干预,并设立空白对照组。通过噻唑蓝(MTT)法测定不同质量浓度鸢尾甲黄素A对RAW264.7细胞活力的影响,Griess法检测NO生成量,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中炎性因子IL-6的含量。结果鸢尾甲黄素A能明显抑制LPS诱导RAW264.7细胞生成NO和IL-6,且作用强度呈浓度依赖性。结论鸢尾甲黄素A的抗炎作用可能与减少炎性因子NO和IL-6的生成有关。