乌蔹莓醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的抗炎作用

目的探讨乌蔹莓70%醇提物对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞炎症模型的作用及其机制。方法MTT法观察不同质量浓度乌蔹莓醇提物对RAW264.7细胞活性的影响,筛选合适的实验剂量。以LPS(1μg/mL)诱导建立细胞炎症模型,同时加入30、60、120μg/mL乌蔹莓醇提物进行处理,24 h后Griess法检测细胞上清液NO水平,DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平,ELISA法检测细胞上清液PGE_(2)、TNF-α、IL-6、IL-1β水平,RT-qPCR法检测细胞TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达,Western blot法检测细胞iNOS、COX-2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Akt、p-Akt、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达。结果乌蔹莓醇提取物质量浓度在180μg/mL及以下时对RAW264.7细胞存活率无明显变化(P>0.05)。与模型组比较,乌蔹莓醇提物组细胞内ROS水平及上清液NO、PGE_(2)、TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低(P<0.01),细胞TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达降低(P<0.05,P<0.01),iNOS、COX-2蛋白表达均下调(P<0.05,P<0.01),p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-Akt/Akt比值均降低(P<0.05,P<0.01),但p-p38 MAPK/p38 MAPK比值无明显变化(P>0.05)。结论乌蔹莓醇提物可拮抗LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应,其机制可能与抑制NF-κB/Akt信号通路,进而抑制炎症相关因子的表达有关。

黄精皂苷对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症模型的抗炎作用及其机制

目的在脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)中研究黄精皂苷通过NF-κB/MAPKs信号通路发挥体外抗炎作用及其机制。方法 MTT比色法检测黄精皂苷对RAW264.7细胞活性的影响,Griess试剂法检测NO释放,ELISA试剂法检测细胞释放TNF-α、IL-6的水平,流式细胞仪检测细胞释放ROS的水平,JC-1荧光染色法检测胞内线粒体膜电位水平变化,Western blot法检测细胞iNOS、COX-2、p-IKKα/β、p-IκBα、p-p65、p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白表达。结果黄精皂苷质量浓度为20、40、80μg/mL时对RAW264.7细胞没有毒性。不同质量浓度的黄精皂苷对LPS诱导RAW264.7细胞导致的NO、TNF-α、IL-6、ROS的释放均有很好的抑制作用,对iNOS、COX-2、p-IKKα/β、p-p65、p-IκBα、p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白表达也有抑制作用。结论黄精皂苷通过抑制NF-κB/MAPKs信号通路来发挥体外抗炎作用。

野菊花水提物对RAW264.7炎症细胞模型的抗炎作用及其机制

目的建立以脂多糖(LPS)诱导的RAW 264.7巨噬细胞为模型,探讨野菊花提取液(CID)通过核转录因子(NF-κB)信号通路发挥抗炎活性的作用及其分子机制。方法以噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度CID对RAW 264.7巨噬细胞活性的影响以筛选适宜的实验浓度;分别采用Griess法和酶联免疫吸附试验(ELISA)测定50、100、200μg·mL^(-1) CID干预后各组细胞中一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的释放量;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)分析各组中环氧合酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的相对表达水平;免疫印迹实验(WB)观察各组中nuclear factor-kappa B p65(NF-κB p65)、inhibitor kappa B(IκB-α)和磷酸化IκB-α(p-IκB-α)的蛋白表达。结果50~200μg·mL^(-1)的CID可显著降低LPS诱导RAW264.7巨噬细胞中NO、TNF-α和IL-6的生成量(P<0.01),并能下调COX-2和iNOX mRNA的相对表达(P<0.01)、下调p-IκB-α、总的NF-κB p65、细胞核NF-κB p65的蛋白相对含量(P<0.01),并上调IκB-α、细胞质NF-κB p65的相对含量(P<0.01)。结论CID可有效降低LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞的炎症因子释放,其机制可能与通过减少TNF-α等关键蛋白表达以及通过抑制NF-κB等炎症信号通路激活来抑制炎症发生有关。

异荭草苷通过MAPK/FoxO信号通路减轻LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应

为了研究异荭草苷(Isoorientin,ISO)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响及其机制,将对数生长期的RAW264.7细胞随机分为对照组、模型组(LPS 1μg·mL^(-1))和异荭草苷(ISO 2.5~40μg·mL^(-1)+LPS)给药组。各组细胞培养24 h后,MTT法检测ISO对RAW 264.7细胞毒性,Griess法检测细胞培养液中一氧化氮(NO)的含量,ELISA法检测细胞培养液中TNF-α的含量,q RT-PCR方法检测环氧合酶2(COX-2)m RNA的表达水平,蛋白质印迹分析法测定细胞中COX-2、JNK、p-JNK、p38、p-p38、FoxO1和FoxO3蛋白的表达。结果表明,与LPS模型组比较,ISO显著抑制LPS诱导的TNF-α(P<0.001)和NO(P<0.01)的产生,且未见其细胞毒性。此外,ISO以剂量依赖的方式显著抑制RAW 264.7细胞COX-2基因(P<0.001)和蛋白(P<0.05)的表达。蛋白质印迹分析显示,ISO显著抑制MAPK信号通路中p-JNK和p-p38的磷酸化,并减少Fox O1/3的核转位。综上所述,ISO可抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应,其作用机制可能与其在MAPK/FoxO信号通路中发挥调节作用有关。

桉柠蒎油抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症因子产生的作用及其机制研究

目的探究桉柠蒎油(ELP)抑制脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞炎症因子产生的作用及作用机制。方法构建LPS刺激的RAW264.7炎症细胞模型。采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性;采用Griess法检测一氧化氮(NO)的产生;采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定LPS处理后培养液中炎症因子的浓度;采用Western-blot法检测蛋白表达水平;采用免疫荧光技术检测LPS处理后核转录因子κB亚基(p65)、激活子蛋白1亚基(c-Jun)和干扰素调节因子3(IRF3)的入核情况。结果ELP在6.25~400μg/mL的剂量范围内对LPS处理的RAW264.7细胞活力没有明显抑制作用。ELP(50~300μg/mL)能有效地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO、前列腺素E2(PGE2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白介素-1β(IL-1β)和受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(Rantes)的产生。ELP能剂量依赖性地降低Toll样受体4(TLR4)信号通路关键蛋白kappa B抑制因子激酶α/β(IKKα/β)、TANK结合激酶1(TBK1)、干扰素调节因子3(IRF3)、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)、p38、p65、核因子kappa B抑制蛋白α(IκBα)、c-Jun和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化水平。ELP同时能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞p65、c-Jun和IRF3的入核。结论ELP能剂量依赖性地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的产生,其作用机制与阻断TLR4/NF-κB、TLR4/AP-1和TLR4/IRF3信号通路有关。

石榴花多糖通过抑制MyD88/NF-κB通路减轻脂多糖诱导小鼠RAW 264.7细胞炎症反应

目的:通过脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠RAW 264.7巨噬细胞炎症模型,探讨了石榴花多糖对细胞的抗炎效果及机制。方法:通过CCK8法检测不同浓度的石榴花多糖对小鼠RAW 264.7细胞活性的影响。LPS刺激建立细胞炎症模型,加入250,125,31.25μg/mL石榴花多糖进行处理,24 h后Griess法检测细胞上清液NO水平,ELISA法检测细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE_(2)水平,RT-qPCR法检测细胞iNOS、COX2、MyD88、NF-κB mRNA表达。结果:石榴花多糖的质量浓度在0.25 mg/mL时,细胞存活率下降,在0.125 mg/mL以下时RAW 264.7细胞活力上升。与模型组相比,石榴花多糖组细胞上清液NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE_(2)水平均降低,RAW 264.7细胞的iNOS、COX2、MyD88、NF-κB mRNA表达降低(P<0.05)。结论:石榴花多糖可以抑制MyD88/NF-κB信号通路,降低NO释放和炎症因子水平,进而减轻LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应。

黄根化合物的分离及对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症的影响

目的研究黄根乙醇提取物对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞炎症模型的作用,并对其具有活性的乙酸乙酯组分的化学成分进行分离纯化。方法利用CCK-8法检测黄根化学成分对RAW264.7细胞活性的影响。利用浓度为500 ng/mL的LPS诱导RAW264.7细胞,以建立细胞炎症模型,Griess检测细胞上清液中一氧化氮(NO)水平,ELISA法检测细胞上清液IL-1β、TNF-α的含量,DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平。再通过溶剂提取法、硅胶色谱柱、高效液相色谱法等方法对黄根乙酸乙酯组分分离纯化。结果质量浓度在100μg/mL及以下的黄根醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分、正丁醇组分和水组分对RAW264.7细胞无毒性。与模型组比较,黄根醇提物、乙酸乙酯组分对细胞中NO、TNF-α、IL-1β和ROS的表达水平具有下调抑制作用。根据理化性质和波谱资料确定化合物结构,从黄根乙酸乙酯部位分离鉴别了4个化合物,根据理化性质和波谱资料确定化合物结构为甲基异茜草素-1-甲醚(1)、1,3-二羟基-2-乙氧甲基蒽醌(2)、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(3)、对苯二甲酸二(2-乙基己)酯(4)及实验证明分离得到单体不具抗炎活性在此不做赘述。结论黄根醇提物组、乙酸乙酯组可拮抗LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应,抑制炎症相关因子的表达。邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯和对苯二甲酸二(2-乙基己)酯为首次从该植物中分离。

葛根素对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的作用机制研究

目的探讨葛根素(puerarin,PUE)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞中的抗炎作用,并揭示其分子机制。方法采用CCK-8比色法分别设置不同浓度的LPS和PUE,观察对RAW264.7细胞活性的影响,筛选出合适的LPS造模浓度及PUE的给药浓度。将细胞分为正常对照组、模型组(1μg/mL)、PUE给药组(12.5、25、50μmol/L)。Griess法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)释放量;ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的含量;qRT-PCR法检测环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)mRNA水平;Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、COX-2、p-IκBα、p-p65蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,不同浓度的LPS诱导24 h,RAW264.7细胞存活率降低,但对细胞增殖无影响(P>0.05),PUE在浓度100μmol/L及以下时对RAW264.7细胞增殖也无影响(P>0.05);与模型组相比,PUE给药组(12.5、25、50μmol/L)NO、TNF-α、IL-1β及IL-6的释放量显著降低(P<0.01),COX-2的蛋白及mRNA表达水平显著降低(P<0.05),i NOS、p-IκBα、p-p65的蛋白表达水平呈浓度依赖性降低(P<0.01)。结论PUE的体外抗炎作用机制与抑制核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路相关。

南极磷虾油对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症反应的抑制作用

为研究南极磷虾油的抗炎作用,以脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞为炎症模型,通过细胞形态、细胞吞噬能力、髓过氧化物酶(MPO)活力、促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)等指标,评价南极磷虾油的抗炎能力,并通过炎症因子及炎症关键酶(iNOS和COX-2)基因的表达,研究其抗炎机理。结果表明,南极磷虾油可以显著缓解LPS引起的细胞分化,抑制细胞吞噬能力和MPO活力的增强,以及炎症因子分泌量的升高(尤其是TNF-α)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的检测结果表明,南极磷虾油可以显著平息LPS引发的炎症关键酶和炎症因子基因的活化。结论:南极磷虾油具备抗炎活性,该活性与其对i NOS和COX-2的调控作用相关。

基于PI3K/AKT/mTOR通路的三百棒促进脂多糖诱导的RAW 264.7细胞自噬并抑制炎症

三百棒来源于芸香科植物飞龙掌血Toddalia asiatica(L.)Lam的根,是一种天然土家族中草药,具有抗炎、抗风湿、抗肿瘤、抗微生物等药理活性。其毒副作用小,疗效显著的特点使之成为当前研究热点。许多天然产物已被证明可通过靶向PI3K/AKT/mTOR介导的自噬来抑制炎症及自身免疫性疾病,本项研究通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路来研究三百棒醇提物(Toddalia asiatica alcohol extract,TAAE)对自噬的影响,用脂多糖(LPS)诱导单核巨噬细胞(RAW 264.7)建立炎症模型,通过细胞毒性检测试剂盒检测TAAE对细胞活力的影响,并筛选出药物的浓度及干预时间,透射电镜和单丹磺酰尸胺染色检测巨噬细胞的生物学功能,酶联免疫吸附法检测上清液中相关炎症因子水平,Western blot检测自噬和通路相关蛋白的表达水平;并采用自噬早期抑制剂(3-MA)和通路PI3K激动剂(740Y-P)进一步验证自噬对炎症和信号通路的影响。实验结果表明TAAE可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进自噬泡的形成、自噬体溶酶体融合和降解,降低LPS处理的RAW 264.7细胞中炎性细胞因子的表达和分泌。总体而言,本研究结果为三百棒的抗炎机制的研究提供了新的线索,并为临床更好的应用三百棒治疗炎症性疾病提供理论依据。

桦褐孔菌醇抑制LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应

探究桦褐孔菌醇(INO)对LPS诱导小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)炎症反应的影响。实验采用CCK-8实验检测RAW264.7细胞活力;利用Hoechst33342和PI检测细胞凋亡;应用酶联免疫吸附法、Griess法测定细胞白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-18(IL-18)分泌及细胞中一氧化氮(NO)含量;利用荧光探针和试剂盒检测活性氧(ROS)生成及细胞中丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)活性。结果表明20μmol/L的INO能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞活力下降,阻止细胞凋亡,能极显著抑制IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-18和NO的分泌(P<0.01),极显著降低细胞中MDA、H2O2的含量(P<0.01),能极显著提高细胞中SOD、CAT、GSH活性(P<0.01)。以上结果表明INO能有效抑制LPS诱导RAW264.7细胞中促炎因子和过氧化物的产生,提高细胞抗炎和抗氧化能力,从而保护细胞免受损伤。

冰片对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型的影响

目的:探究冰片的体外抗炎活性及其相关的分子机制.方法:选取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞,使用不同浓度(0.03μg/mL、0.3μg/mL、3μg/mL、30μg/mL、300μg/mL、600μg/mL)冰片和不同浓度(0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL)脂多糖(LPS)分别作用细胞24h,采用CCK-8法检测细胞活力,筛选出活力较好的冰片和LPS浓度.LPS刺激RAW264.7巨噬细胞建立炎症细胞模型,选择醋酸地塞米松(Dexamethasone,Dex)作为阳性对照药,分别设置空白(KB)组、模型(MX)组、阳性(YX)组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,药物组分别使用相应浓度的药物预处理细胞0.5h后,各组(除KB组)再用LPS刺激23.5h.倒置显微镜下观察细胞形态,一步法测定细胞培养上清液中一氧化氮(NO)的含量,Westernblot法检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路、核转录因子E2相关因子2(Nrf2)通路及核因子(NF-κB)通路中相关蛋白的表达水平,DCFH-DA荧光探针检测活性氧(ROS)含量.结果:冰片浓度<600μg/mL和LPS浓度<1.5μg/mL时细胞活力未受明显影响,并进一步优化出1.5μg/mL、15μg/mL、150μg/mL分别作为冰片抑制细胞炎症的低、中、高剂量,1.2μg/mLLPS作为刺激RAW264.7细胞的最佳浓度.倒置显微镜下观察可见,KB组大部分细胞呈圆形,轮廓较为清楚;MX组细胞伪足和肿胀分化较为严重,且胞质内可见白色透明小泡;YX组细胞伪足回缩,趋于正常;冰片三个剂量组均能不同程度地抑制细胞分化.冰片可剂量依赖性地降低炎症因子NO的水平.Western blot结果显示,冰片可激活Nrf2通路,促进Nrf2蛋白表达,同时抑制MAPKs及NF-κB通路活化,降低ERK、JNK、p38和p65的磷酸化水平.冰片可剂量依赖性地抑制ROS的过度表达.结论:冰片可剂量依赖性地抑制MAPKs和NF-κB通路的活化,以及激活Nrf2蛋白,降低相关炎症因子NO的表达水平,进而发挥细胞抗炎活性.

泰国伯克霍尔德菌感染RAW264.7细胞模型的建立及感染机制的初步探讨

目的建立泰国伯克霍尔德菌(Burkholderia thailandensis,B.thailandensis)感染小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞模型,为进一步研究泰国伯克霍尔德菌致病机制奠定基础。方法配制相同浓度的泰国伯克霍尔德菌菌液,感染不同稀释浓度的RAW264.7细胞,通过细菌侵袭实验分析不同时相点的泰国伯克霍尔德菌入胞率和胞内生存状态,通过透射电镜和Giemsa染色动态观察胞内感染和宿主细胞的超微病理变化,通过流式检测不同时相点诱导细胞凋亡情况,采用LEGENDplexTM试剂检测细胞上清炎症因子的表达情况。结果透射电镜结果显示感染12 h后部分细菌侵入细胞内;通过Giemsa染色形态观察,泰国伯克霍尔德菌感染后最早8 h可观察到典型多核巨细胞(multinucleate giant cells,MNGC)的形成;随着感染时间的延长,MNGC形成率和炎症因子表达逐渐升高。结论成功构建了泰国伯克霍尔德菌感染RAW264.7细胞模型,明确了泰国伯克霍尔德菌对宿主细胞产生的炎性反应,为深入研究泰国伯克霍尔德菌感染宿主细胞的机制奠定了实验基础。

苦杏仁苷对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型的影响

目的研究苦杏仁苷(Amygdalin)体外对脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7炎症模型的影响。方法采用MTT法检测苦杏仁苷对RAW264.7细胞及其LPS(0.5μg·m L^(-1))诱导后增殖作用的影响;q RTPCR法检测RAW264.7细胞炎症模型的炎症因子IL-17A、IL-23以及趋化因子CCL2、CCL5的m RNA表达;Western Blot法检测胞浆和胞核NF-κB p65以及p38、p-p38的蛋白表达。结果与正常对照组比较,苦杏仁苷在6.25~200μmol·L^(-1)浓度范围对RAW264.7细胞生长没有明显影响(P>0.05),而400μmol·L^(-1)可导致RAW264.7细胞活力明显下降(P<0.001)。与正常对照组比,LPS作用后RAW264.7细胞活力下降,细胞增殖受到抑制(P<0.05);LPS刺激3h后可诱导RAW264.7细胞炎症因子IL-17A、IL-23以及趋化因子CCL2、CCL5 m RNA表达显著上升(P<0.05,P<0.01);LPS作用1h后可引起RAW264.7细胞的胞核NF-κB p65表达明显上调,胞浆NF-κB p65表达下调,胞核与胞浆比值明显上调(P<0.05),p-p38蛋白表达也显著上升(P<0.001)。与模型组比较,5μmol·L^(-1)苦杏仁苷对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型未见明显变化(P>0.05),而20,50μmol·L^(-1)苦杏仁苷作用后细胞增殖抑制状态恢复(P<0.05,P<0.01);苦杏仁苷(50μmol·L^(-1))提前干预后,IL-17A、IL-23、CCL2及CCL5 m RNA表达均显著下降(P<0.01,P<0.001);RAW264.7细胞NF-κB p65的胞核与胞浆比值明显下调,p-p38蛋白表达也显著下调,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论苦杏仁苷对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7炎症模型的干预作用可能与抑制炎症因子IL-17A、IL-23以及趋化因子CCL2、CCL5的表达,抑制NF-κB、p38MAPK信号通路的过度激活有关。

猪伪狂犬病毒体外诱导RAW264.7细胞炎症反应模型的建立

【目的】探讨猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染对小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)炎症反应的影响,确定PRV的最佳感染剂量和感染时间,为建立RAW264.7细胞体外病毒感染炎症反应模型打下基础。【方法】PRV按10倍递增稀释成10-5~10-1 PRV稀释液,感染RAW264.7细胞并孵育1.5 h,弃病毒液后加入含5%胎牛血清的DMEM维持培养液继续培养,分别于继续培养2、4、8、12、24和48 h时收集细胞上清液,采用ELISA测定IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1和IFN-γ分泌水平及环氧合酶(COX-1和COX-2)活性,并以CCK-8法测定细胞活性。【结果】以PRV感染RAW264.7细胞4~48 h后均能通过PCR扩增获得PRV核酸的特异性条带,故选择4~48 h作为后续研究的PRV感染时间范围;10-2 PRV~10-1 PRV感染可显著降低RAW264.7细胞活性(P<0.05,下同),10-3 PRV组仅在培养48 h时出现下降趋势,而10-5 PRV~10-4 PRV感染对RAW264.7细胞活性无显著影响。PRV感染RAW264.7细胞后,其胞内炎症因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平整体上呈升高趋势,其中10-3 PRV感染RAW264.7细胞12 h能显著或极显著(P<0.01)提高IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平;10-4 PRV~10-1 PRV感染组的IL-10分泌水平均呈升高趋势,而10-5 PRV感染组在感染8和24 h时IL-10分泌水平明显低于空白对照组,至感染48 h所有病毒感染组的IL-10分泌水平均降低;10-3 PRV~10-1 PRV感染8~24 h能有效提高RAW264.7细胞的COX-2活性,但对COX-1活性的影响不明显。【结论】PRV感染能诱导RAW264.7细胞发生炎症反应,其中10-3 PRV体外感染RAW264.7细胞8~12 h是建立RAW264.7细胞炎症反应模型的最佳条件。该模型可应用于PRV感染与RAW264.7细胞炎症反应相关干预药物的研究,为进一步揭示PRV感染机理及开发抗病毒感染药物提供理论依据。

桑白皮中sanggenon B对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症反应的影响

采用硅胶柱层析等方法从桑白皮中分离出抗炎活性化合物,通过波谱分析进行化合物结构鉴定。体外培养RAW264.7细胞,构建脂多糖(LPS)诱导炎症模型,采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞活性,利用Griess法和酶联免疫吸附(ELISA)法分别检测炎症因子一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)的释放量,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术分别测定诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)mRNA和蛋白的表达水平。结果显示:桑白皮乙醇提取物(MRE)能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的分泌水平,且呈现量效关系。对桑白皮进行分离,得到1种抗炎活性化合物,经波谱数据分析,确定其为已知的Diels-Alder加合物桑根酮B(sanggenon B)。抗炎活性表明,sanggenon B显著下调了炎症因子NO、TNF-α、IL-6的合成,并抑制了RAW264.7细胞中i NOS、COX-2 mRNA和蛋白的表达水平。研究表明,从桑白皮中分离出的sanggenon B具有一定的抗炎作用,其抗炎机制可能与调控炎症因子的合成,降低i NOS、COX-2表达有关。

β-胡萝卜素对脂多糖刺激巨噬细胞RAW264.7炎症因子的影响及其机制

目的:探讨β-胡萝卜素对脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞RAW264.7炎症因子的影响及其机制。方法:采用5μg/ml的LPS刺激巨噬细胞24 h后用不同浓度的β-胡萝卜素(20、40、80、160μmol/L)处理细胞3 h,MTT法测细胞活性,荧光定量PCR测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA相对表达量,ELISA测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌量,Western blot测NF-κB p65蛋白相对表达量。5μg/ml的LPS和不同浓度的NF-κB抑制剂PDTC(1、5、10μg/ml)共同处理巨噬细胞24 h,Western blot测NF-κB p65蛋白相对表达量,荧光定量PCR、ELISA测炎症因子的表达和分泌。比较LPS+PDTC组和LPS+PDTC+β-胡萝卜素组炎症因子和NF-κB p65蛋白相对表达的变化。结果:与LPS组相比,不同浓度的β-胡萝卜素对LPS刺激的巨噬细胞的细胞活性有提升作用,对炎症因子和NF-κB p65蛋白的表达有抑制作用;抑制NF-κB蛋白的表达可以抑制LPS刺激的巨噬细胞炎症因子的分泌;LPS+PDTC+β-胡萝卜素组对炎症因子的抑制作用比LPS+PDTC组明显,且差异显著(P<0.05),但两组对NF-κB p65蛋白的表达不明显。结论:β-胡萝卜素可以通过抑制NF-κB通路中NF-κB p65蛋白的表达抑制LPS刺激的巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌,且此通路不是唯一相关的通路。

木犀草素对活化的RAW264.7巨噬细胞分泌炎症因子的影响

目的炎症是机体的一种防御性反应,但过度的炎症又会导致机体损伤。文中旨在探讨木犀草素对LPS和IFN-γ诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达的影响及机制。方法将细胞分为对照组、LPS+IFN-γ组、木犀草素低、中、高剂量组。对照组:不加药的RAW264.7细胞;LPS+IFN-γ组:终浓度为10 ng/m L LPS+20 ng/m L IFN-γ刺激细胞M1极化;木犀草素低剂量组:LPS+IFN-γ与终浓度为5μmol/L的木犀草素同时刺激;木犀草素中剂量组:LPS+IFN-γ与10μmol/L的木犀草素共同刺激;木犀草素高剂量组:LPS+IFN-γ与20μmol/L的木犀草素共同刺激。激光共聚焦显微镜观察细胞形态的变化;Real time-q PCR检测诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、IL-1β和IL-6基因的表达,ELISA检测上清TNF-α和IL-6的分泌,Western blot检测蛋白通路phospho-STAT3(ser727)(p-STAT3)的变化。结果活化的RAW264.7细胞形态发生明显变化,与对照组比较,其余4组i NOS、IL-1β、IL-6均降低(P<0.05);与LPS+IFN-γ组i NOS(98.91±10.65)比较,木犀草素高剂量组(29.52±3.07)明显降低(P<0.01);与LPS+IFN-γ组IL-1β(110.69±4.12)比较,木犀草素中剂量组、木犀草素高剂量组(78.38±8.65、41.59±6.80)明显降低(P<0.05),与LPS+IFN-γ组IL-6(394.10±33.47)比较,木犀草素低、中、高剂量组(177.51±19.28、106.14±5.63、27.15±1.26)明显降低(P<0.05)。LPS+IFN-γ能诱导RAW264.7细胞M1表型的p-STAT3(ser727)上调,与对照组比较,M1、木犀草素低、中剂量组p-STAT3明显升高(P<0.05),与LPS+IFN-γ组比较,木犀草素低、中、高剂量组M1源性的p-STAT3-ser表达下调(P<0.05),并呈剂量依赖性。与对照组比较,M1、木犀草素低、中剂量组IL-6、TNF-α表达明显升高(P<0.05),与LPS+IFN-γ组比较,木犀草素低、中、高剂量组IL-6、TNF-α表达明显下调(P<0.05)。其中IL-6呈浓度依赖性,TNF-α不呈浓度依赖性。结论木犀草素可能通过下调p-STAT3抑制RAW264.7细胞致炎因子的表达,从而发挥抗炎作用。

不同剂量异鼠李素对炎症损伤小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响及其机制探讨

目的观察异鼠李素(ISO)对炎症损伤小鼠巨噬细胞RAW264. 7增殖能力的影响,并探讨其机制。方法取对数生长期RAW264. 7细胞,将细胞分为5组,低、中、高剂量组分别加入已经配好含10 ng/m L脂多糖(LPS)及低、中、高剂量ISO(50、100、200μg/m L)的溶液,模型组加入含10μg/m L LPS的1640培养基(含10%FBS),对照组加入含10%溶剂对照的1640完全培养基。测算各组细胞增殖指数,检测各组一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)。结果与对照组比较,模型组细胞12、24、36、48 h细胞增殖指数增加(P均<0. 05);与模型组比较,低剂量组24、36 h及中剂量组和高剂量组12、24、36、48 h细胞增殖指数减少(P均<0. 05);与低剂量组比较,中剂量组24 h及高剂量组24、48 h细胞增殖指数减少(P均<0. 05)。与对照组比较,模型组NO、TNF-α水平升高(P均<0. 05);与模型组比较,低剂量组NO水平及中剂量组和高剂量组NO、TNF-α水平降低(P均<0. 05);与低剂量组比较,中剂量组和高剂量组NO、TNF-α水平降低(P均<0. 05)。结论 ISO可抑制RAW 264. 7细胞增殖能力,且呈剂量依赖性,高剂量作用最大;机制可能与抑制NO、TNF-α有关。

暖心康通过“代谢-炎症”网络调控巨噬细胞极化对心肌梗死后小鼠心室重构的影响

目的探究暖心康(红参、毛冬青)通过“代谢-炎症”网络调控巨噬细胞极化改善心肌梗死后小鼠心室重构的作用机制。方法(1)将30只C57BL/6J雄性小鼠随机分为3组:假手术组、模型组、暖心康组(1.65 g·kg^(-1)),每组10只;采用左前降支冠状动脉结扎术复制心肌梗死小鼠模型;灌胃给药,每日1次,连续4周。采用Masson染色法检测心肌组织胶原沉积情况;超声检测小鼠心功能:左室射血分数(LVEF)、收缩末期左室前壁厚度(LVAWS)及舒张末期左室前壁厚度(LVAWD);流式细胞术检测小鼠心脏巨噬细胞分布情况;qPCR法检测心脏组织乳酸脱氢酶A(LDHA)、肉碱棕榈酰转移酶1(CPT-1)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)、琥珀酸脱氢酶(SDHa)mRNA表达。(2)按照1.15 g·kg^(-1)剂量给予大鼠暖心康混悬液灌胃,每日2次,持续5 d,制备暖心康含药血清。采用脂多糖(LPS)诱导RAW 264.7细胞构建促炎型巨噬细胞模型。细胞分组:空白血清对照组(含5%空白血清+5%胎牛血清的培养基)、暖心康含药血清组(含5%暖心康含药血清+5%胎牛血清的培养基)、脂多糖组(含5%空白血清+5%胎牛血清的培养基+200μg·mL^(-1)脂多糖)、暖心康含药血清+脂多糖组(含5%暖心康含药血清+5%胎牛血清的培养基+200μg·mL^(-1)脂多糖),干预16 h。采用糖酵解压力测试实验检测RAW 264.7细胞糖酵解水平;qPCR法检测RAW 264.7细胞线粒体丙酮酸转运载体(MPC1)mRNA表达;MitoSox Red荧光染色法检测RAW 264.7细胞线粒体氧化应激损伤程度。结果(1)与假手术组比较,模型组小鼠的心脏胶原纤维蓝染面积明显增加,并伴有室壁变薄,左心室腔增大;LVEF、LVAWS、LVAWD等心功能指标水平均显著降低(P<0.01,P<0.001);小鼠心脏组织中LDHA、CPT-1 mRNA表达明显上调(P<0.05),GLUT4、IDH、SDHa mRNA表达显著下调(P<0.05,P<0.01),CD86染色阳性细胞数量显著增加(P<0.001)。与模型组比较,暖心康组小鼠的心脏胶原纤维沉积明显减少,且室壁厚度增加;LVEF、LVAWS、LVAWD等心功能指标水平均显著升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001);小鼠心脏组织中LDHA、CPT-1 mRNA表达显著下调(P<0.01,P<0.001),GLUT4、SDHa、IDH mRNA表达显著上调(P<0.01),CD86阳性细胞数量显著减少(P<0.001)。(2)与空白血清对照组比较,暖心康含药血清组巨噬细胞的糖酵解水平、ROS水平均无明显变化(P>0.05),而脂多糖组巨噬细胞的糖酵解水平、ROS水平均显著升高(P<0.01),MPC1 mRNA表达显著下调(P<0.001)。与脂多糖组比较,暖心康含药血清+脂多糖组的巨噬细胞糖酵解水平、ROS水平均显著降低(P<0.05,P<0.01),MPC1 mRNA表达显著上调(P<0.001)。结论暖心康能够减轻小鼠心肌梗死后的心肌纤维化及心室重构,改善心功能,其作用机制可能与下调心脏组织LDHA mRNA表达,上调GLUT4 mRNA表达,改善心肌梗死后心脏葡萄糖摄取能力,抑制促炎型巨噬细胞糖酵解,增加SDHa及IDH的表达以减轻琥珀酸与柠檬酸堆积,减少活性氧(ROS)生成,从而减少促炎型巨噬细胞过度极化有关。