基于RBL-2H3细胞脱颗粒抑制作用的体外抗过敏活性益生菌的筛选及鉴定

为探究乳酸菌的抗过敏活性,本研究采用传统分离技术从发酵蔬菜中获得乳酸菌,并进行益生菌体外评价,结合RBL-2H3细胞脱颗粒抑制实验筛选具有抗过敏活性的益生菌。结果表明,从发酵蔬菜中分离的4株菌株表现出良好的益生特性和安全性;所选4株乳酸菌对RBL-2H3细胞脱颗粒释放β-己糖胺酶均具有较高的抑制作用,并对RBL-2H3细胞脱颗粒释放组胺、肿瘤坏死因子-α和白介素-4均有明显的下调作用,具有作为抗过敏活性益生菌的可能性。4株菌株经16S rDNA测序鉴定为植物乳杆菌2株、发酵乳杆菌和副干酪乳杆菌各1株。

基于RBL-2H3细胞的复杂基质生化药类过敏反应评估及体内外相关性评价

目的 建立适宜的细胞模型对复杂基质生化药骨肽类注射剂和垂体后叶注射剂类过敏反应风险进行评估,并与类过敏反应体内评价模型实验结果的相关性进行比较。方法 采用RBL-2H3细胞脱颗粒实验,选择β-氨基己糖苷酶作为适宜的评价指标以评估骨肽类注射剂和垂体后叶注射剂对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响;采用实验室已建立的类过敏反应体内评价模型小鼠耳郭蓝染实验,以蓝染率及伊文思蓝升高率为指标评价两种复杂基质生化药注射剂体内类过敏反应风险的相关性。结果 骨肽类注射剂可诱导β-氨基己糖苷酶的释放率增加,与阴性对照组相比差异存在统计学意义(P <0.01),垂体后叶注射剂不可诱导β-氨基己糖苷酶的释放。小鼠耳郭蓝染实验高剂量组中,复方骨肽注射液和骨肽注射液为临床等效剂量的6.67、10倍,类过敏反应阳性率分别为100%、66.7%;随着剂量的降低,复方骨肽注射液和骨肽注射液为临床等效剂量的1.67、2倍时,类过敏反应均判定为阴性,垂体后叶注射剂类过敏反应均为阴性,与体外结果一致。结论通过结合RBL-2H3细胞脱颗粒模型与小鼠耳郭蓝染模型可对药物类过敏反应风险进行评估和筛查,同时也可为复杂基质类生化药类过敏反应物质基础及机制的研究评价提供参考和手段。

几种常见中药注射剂对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响

目的通过研究几种常见中药注射剂(TCMI)对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响,探讨RBL-2H3细胞模型应用于体外评价TCMI引起类过敏反应的可行性。方法体外培养RBL-2H3细胞,血塞通等7种TCMI与其共同培养,通过中性红染色法计数脱颗粒的RBL-2H3细胞,显色法计算β-氨基己糖苷酶释放率,ELISA法检测培养上清中组胺含量,观察TCMI对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响。结果正常RBL-2H3细胞出现少量脱颗粒现象,血塞通、清开灵、双黄连、脉络宁、香丹、穿琥宁等能显著引起细胞脱颗粒;血塞通、穿琥宁和柴胡注射液能不同程度促进β-氨基己糖苷酶的释放;血塞通、清开灵注射液可显著引起RBL-2H3细胞组胺释放。结论RBL-2H3细胞脱颗粒的检测方法敏感、重复性好,其结果与临床报道有一定的相关性,提示其有评价TCMI所致的类过敏反应的潜在应用价值。

青藤碱对RBL-2H3肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响

目的通过研究青藤碱对肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响,深入探讨青藤碱的抗炎作用机理。方法应用细胞培养,流式细胞术等方法,观察青藤碱等药物对体外培养的RBL-2H3肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响。结果青藤碱对肥大细胞增殖有明显的抑制作用,其IC50约为1mmol/L,并能促进肥大细胞凋亡,且对RBL-2H3肥大细胞活化脱颗粒有较强的抑制作用。结论青藤碱可能部分通过下调肥大细胞功能发挥抗炎抗风湿作用。

RBL-2H3细胞诊断过敏性休克的可行性初探

目的 :探索诊断过敏性休克的体外检测方法。方法 :建立豚鼠过敏性休克模型 ,培养RBL 2H3细胞株 ,用致敏动物血清在体外诱导该细胞脱颗粒 ,观察其形态改变及测定组胺释放量与细胞表面AnnexinV标记阳性率。结果 :RBL 2H3细胞在致敏血清刺激下活化 ,在抗原再次攻击后可以脱颗粒 ,AnnexinV阳性率与组胺释放量呈正比 ,二者与致敏血清的滴度呈剂量依赖关系。结论 :RBL 2H3可望用于过敏性疾病诊断及变应原筛选 。

基于RBL-2H3细胞模型的Ⅰ型过敏反应和类过敏反应研究

Ⅰ型速发型过敏是常见的药物不良反应,长期受到人们的广泛重视和研究。类过敏反应自20世纪80年代在造影剂和麻醉剂的使用中发现以来,其发生频率不断提高,尤其随着中药注射剂的广泛使用而越来越受到重视。但其确切机理还尚未得到阐明。RBL-2H3细胞是一类表面含有丰富的IgE受体鼠嗜碱性淋巴细胞,在研究过敏反应方面有重要作用。本文就如何以RBL-2H3细胞构建这两类过敏反应的体外细胞模型及如何检测其效应分子进行简单阐述,同时介绍这两类反应机制的研究进展。

莽草酸抑制大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒和组胺释放

目的研究莽草酸对大鼠RBL-2H3细胞增殖和化合物48/80(C48/80)诱导后细胞脱颗粒情况及其机制。方法MTT法检测(3、10、30)μg/m L的莽草酸处理后,RBL-2H3细胞的增殖情况,甲苯胺蓝染色观察C48/80诱导RBL-2H3细胞脱颗粒的情况,底物法检测(0、12.5、25、50、80、100)μg/m L C48/80处理后,RBL-2H3细胞内β-氨基己糖苷酶的释放,ELISA检测各处理组细胞上清液中组胺的含量。结果 (3、10、30)μg/m L莽草酸对RBL-2H3细胞增殖无明显抑制作用,RBL-2H3细胞脱颗粒与C48/80的剂量有一定量效关系;莽草酸能抑制大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒;与阳性对照组相比,莽草酸处理C48/80刺激后的RBL-2H3细胞,其β-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放量均显著降低。结论莽草酸可抑制大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒,减少组胺释放。

血塞通致RBL-2H3细胞与原代肥大细胞脱颗粒特性的比较

【目的】通过比较血塞通注射液等在类过敏试验中致RBL-2H3细胞与大鼠腹腔原代肥大细胞脱颗粒特性的异同,以评价2种细胞在中药注射液类过敏试验中的意义。【方法】选用已经明确能引起类过敏反应的3种供试品即血塞通注射液、Compound 48/80和吐温80,分别与RBL-2H3细胞和大鼠腹腔肥大细胞共同孵育1 h,通过β-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放率、释放量等的检测,分析比较脱颗粒特性的异同,同时观察了不同浓度血塞通注射液对脱颗粒程度的影响。【结果】2种细胞在血塞通注射液、Compound 48/80和吐温80的直接刺激下均出现脱颗粒现象,脱颗粒程度与血塞通注射液呈剂量依赖性;原代肥大细胞β-氨基己糖苷酶释放率、组胺释放量和释放率均显著高于RBL-2H3细胞,2种细胞比较差异有统计学意义(P<0.01)。【结论】在类过敏反应脱颗粒试验中,RBL-2H3细胞和原代大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒具有相同趋势,均可用于中药注射液类过敏评价,RBL-2H3细胞应用方便,而肥大细胞更加敏感。

双黄连注射液中8种主要成分对RBL-2H3细胞的影响

目的以双黄连注射液为研究对象,探讨其中8种主要成分的致敏性。方法采用RBL-2H3细胞模型,分别用双黄连注射液、黄芩苷、黄芩素、连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸处理细胞,测定细胞脱颗粒率以及β-氨基己糖苷酶和5-羟色胺的释放率。结果双黄连注射液、绿原酸及隐绿原酸能直接引起RBL-2H3细胞脱颗粒,并能显著提高细胞内β-氨基己糖苷酶和5-羟色胺的释放,其他成分无显著的致敏性。结论双黄连注射液的致敏性可能是由绿原酸和隐绿原酸引起的。

丹皮酚对RBL-2H3肥大细胞活化脱颗粒的影响

目的通过建立体外抑制肥大细胞脱颗粒的药效学模型,探讨丹皮酚抗Ⅰ型变态反应作用机制。方法用MTT比色法检测不同浓度的丹皮酚对RBL-2H3肥大细胞增殖的影响。通过ELISA法,明确体外RBL-2H3细胞活化分泌组胺及TNF-α动力学特征。检测不同浓度药物对RBL-2H3肥大细胞分泌组胺及TNF-α的影响。结果丹皮酚对RBL-2H3细胞增殖有抑制作用,IC50值为0.22 mg/mL。RBL-2H3细胞活化脱颗粒,分泌组胺的释放率在前30 m in上升较快,30 m in后上升进入平台期;TNF-α分泌的量在1h达高峰。丹皮酚抑制RBL-2H3细胞释放组胺和TNF-α作用不弱于色甘酸钠0.1,0.5 mg/mL。丹皮酚浓度的对数与其对RBL-2H3细胞释放组胺和TNF-α的抑制率呈线性相关(P=0.000<0.01)。结论丹皮酚呈剂量依赖性抑制RBL-2H3细胞分泌组胺和TNF-α。

hFcεRIα/RBL-2H3细胞株的构建与评价

目的构建稳定表达人FcεRIα(h FcεRIα)亚基的RBL-2H3细胞株。方法利用RT-PCR技术克隆h FcεRIα基因,构建真核表达载体p CI-neo-h FcεRIα。脂质体介导法转染RBL-2H3细胞,G418筛选获得稳定转染细胞株。利用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法鉴定转染结果。结果通过对脂质体介导转染体系进行优化,转染效率可高达75.38%。经Western blot、免疫荧光及RT-PCR鉴定,h FcεRIα基因在RBL-2H3细胞内成功表达。结论成功构建h FcεRIα/RBL-2H3细胞模型,为深入研究Ig E与FcεRI作用机制及相关药物开发提供了实验基础。

丹参酮对RBL-2H3肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响

研究丹参酮对肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响,深入探讨丹参酮的抗炎药理机制。应用细胞培养、流式细胞术等方法,观察丹参酮等药物对体外培养的RBL-2H3肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响。结果:丹参酮I、IIA对肥大细胞增殖有明显的抑制作用,其IC50约为20μmol/L,并能明显促进细胞凋亡,且对RBL-2H3细胞活化脱颗粒有较强的抑制作用。结论:丹参酮对肥大细胞功能具有明显的抑制作用,可能是其发挥抗炎作用的一个重要方面。

小青龙汤对体外培养RBL-2H3细胞增殖及凋亡的影响

观察小青龙汤对体外培养RBL-2H3细胞增殖及凋亡的影响,探讨小青龙汤治疗过敏性鼻炎的机理。方法:取RBL-2H3细胞,含10%FBS的MEM培养液培养,传代后接细胞培养板,MTT法检测各浓度组细胞的增殖情况,倒置显微镜拍照记录细胞生长情况;Hoechst33258荧光染色法观察各组细胞凋亡情况,荧光倒置显微镜观察并拍照记录。结果:小青龙汤可抑制体外培养RBL-2H3细胞的增殖,呈一定的浓度依赖性,并可促进体外培养RBL-2H3细胞的凋亡。结论:小青龙汤对过敏性鼻炎的治疗作用与其抑制肥大细胞增殖及促进其凋亡有关。

氧化苦参碱对RBL-2H3肥大细胞活化脱颗粒的影响

目的:探讨氧化苦参碱的抗I型变态反应的作用机制。方法:用MTT比色法检测不同浓度的氧化苦参碱对RBL-2H3细胞活化的影响。根据MTT比色法分别选择氧化苦参碱5个不同的实验浓度,并以色甘酸钠作为阳性对照。以C48/80刺激RBL-2H3细胞活化脱颗粒,测不同浓度药物对RBL-2H3细胞分泌组胺及TNF-α变化。结果:氧化苦参碱对RBL-2H3细胞的增殖有抑制作用。氧化苦参碱能抑制RBL-2H3细胞释放组胺及TNF-α,抑制作用不弱于色甘酸钠组。氧化苦参碱浓度的对数与RBL-2H3细胞释放组胺和TNF-α抑制率呈高度线性关系。结论:氧化苦参碱能抑制RBL-2H3细胞分泌组胺和TNF-α,该抑制作用呈剂量依赖性。其治疗I型变态反应性皮肤病可能和它抑制肥大细胞活化脱颗粒有关。

RBL-2H3细胞评价血塞通注射剂致敏模型建立

目的建立最佳血塞通注射液致RBL-2H3细胞过敏介质释放评价模型。方法分别从细胞破坏法、渗透压、细胞体积、反应时间以及底物浓度等方面考察确定组胺和己糖胺酶反应体系,并对96孔板和24孔板进行方法学考察。结果冻融法无法完全破坏细胞,0.1%Triton X-100被认为是最佳的细胞破碎方法。反应时间为30 min,样品含水量需在80%以下。最终确定组胺和己糖胺酶的最佳反应体系,96孔板和24孔板标准偏差均小于15%,24孔板精密度和重复性稍高于96孔板。结论建立了RBL-2H3细胞评价血塞通注射剂致敏性模型。96孔板和24孔板均可作为评价血塞通注射剂致RBL-2H3细胞过敏指标释放的载体。

茶属植物及茶多酚类成分对抗原诱导RBL-2H3细胞过敏反应的抑制作用

目的:研究茶属植物及茶多酚类和嘌呤碱类成分对抗原刺激RBL-2H3细胞脱颗粒及肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素4(IL-4)释放的抑制作用。方法:测定β-hexosaminidase的释放以评价脱颗粒反应的指标,酶联免疫吸附法测定TNF-α和IL-4的释放,评价茶中主要成分的抗过敏活性。结果:茶属植物均有抑制RBL-2H3细胞脱颗粒作用,其中花类表现出较叶类更强的抗过敏活性;EGCG对抗原刺激的RBL-2H3细胞即刻相(IC50:234μmol·L-1)和延缓相反应(IL4,IC50:158μmol·L-1),及钙离子载体A23187诱导的脱颗粒反应均有抑制作用(IC50:126μmol·L-1)。结论:茶属植物和EGCG具有明显的抗过敏作用。

反转录病毒介导靶向瞬时感受器电位M7基因siRNA抑制RBL-2H3细胞的活化

背景:钙离子在肥大细胞活化后的脱颗粒反应起重要作用。瞬时感受器电位M7(transient receptor potential melastatin7,TRPM7)是肥大细胞重要的候选通道。目的:构建携带大鼠靶向TRPM7-siRNA的反转录病毒载体并检测其对大鼠RBL-2H3细胞抗原活化的影响。方法:实验设计3个TRPM7-siRNA序列和1个无关对照序列,克隆到酶切的pSuper-retro-neo-GFP反转录病毒载体,用重组质粒pSuper-retro-neo-GFP-shTRPM7-(1,2,3)采用脂质体Lipofectamine 2000转染RBL-2H3细胞,采用Western blot检测干扰效率。筛选出最有效的pSuper-retro-neo-GFP-siTRMP7与包装质粒共转染293FT细胞生成反转录病毒并感染RBL-2H3细胞,荧光实时定量PCR及Western blot检测TRPM7-siRNA的沉默效果。检测β-氨基已糖苷酶活性探讨RBL-2H3细胞抗原活化程度的改变。结果与结论:转染后的各组细胞中siTRPM7-3转染组的沉默效率最高(P<0.05)。pSuper-retro-neo-GFP-siTRMP7-3干扰组的TRPM7基因的mRNA水平和蛋白水平显著下调,致敏后其β-氨基已糖苷酶活性明显降低(P<0.05)。结果提示,降低TRPM7基因的表达可抑制RBL-2H3细胞的抗原活化。

青藤碱对大鼠肥大细胞RBL-2H3活化的影响及机制

目的探讨青藤碱对大鼠肥大细胞RBL-2H3活化的影响及其作用机制。方法将培养的大鼠RBL-2H3细胞随机分为对照Ⅰ组和青藤碱组。青藤碱组用青藤碱溶液处理,对照Ⅰ组则用PBS处理。利用生化法检测两组细胞培养上清中β-氨基己糖苷酶释放率,并用荧光定量PCR和Western blot方法检测细胞中信号调节蛋白α(SIRPα)mRNA和蛋白的表达水平。构建SIRPα过表达重组质粒或SIRPαsiRNA,将RBL-2H3细胞分为对照Ⅱ组、空载质粒组、过表达组、对照Ⅲ组、空白组、沉默组,对照Ⅱ组和对照Ⅲ组不进行转染,空载质粒组转染空白质粒,过表达组转染SIRPα过表达质粒,空白组转染非特异性siRNA,沉默组转染SIRPαsiRNA,转染结束后向对照Ⅲ组、空白组、沉默组添加青藤碱处理,并检测SIRPα的表达及炎症因子白细胞介素(IL)-4、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。结果与对照Ⅰ组比较,青藤碱组细胞中β-氨基己糖苷酶释放率显著降低(P=0.000),SIRPαmRNA及蛋白表达量均显著升高(P=0.000)。与对照Ⅱ组和空载质粒组比较,过表达组细胞中SIRPαmRNA表达量显著升高(P=0.000),IL-4、IL-6和TNF-α含量均明显降低(P=0.000)。与对照Ⅲ组和空白组比较,沉默组细胞SIRPαmRNA表达量显著降低(P=0.000),IL-4、IL-6和TNF-α含量均显著升高(P=0.000)。结论青藤碱处理能够显著抑制大鼠RBL-2H3细胞活化并上调细胞中SIRPα基因的表达,而SIRPα基因介导了青藤碱的这种抑制作用。

双黄连注射液对致敏RBL-2H3细胞组胺释放的影响

目的:建立致敏RBL-2H3细胞模型,观察双黄连注射液对其组胺释放的影响,探讨该模型用于体外评价中药注射剂致敏性的可行性。方法:双黄连注射液联合弗氏佐剂免疫Wistar大鼠,收集致敏后大鼠血清,将其与体外培养RBL-2H3细胞孵育12h,建立致敏RBL-2H3细胞模型,双黄连注射液与致敏RBL-2H3细胞共培养1.5h,ELISA法检测培养上清中组胺含量。结果:双黄连注射液致敏大鼠血清IgE水平明显升高,与对照组相比P<0.05,差异有统计学意义。组胺实验结果显示,双黄连注射液可显著引起致敏RBL-2H3细胞组胺释放,与对照组相比P<0.05,差异有统计学意义。结论:双黄连注射液可促进致敏RBL-2H3细胞释放组胺,提示RBL-2H3细胞模型具有评价中药注射液所致过敏反应的潜在应用价值。

清开灵注射液对RBL-2H3肥大细胞脱颗粒的影响

目的:清开灵注射液对RBL-2H3细胞脱颗粒和组胺释放影响。方法:取不同浓度的清开灵注射液与RBL-2H3肥大细胞系共培养,在放大镜下观察比较细胞脱颗粒情况;检测肥大细胞释放β-氨基己糖苷酶活性A值,并计算β-氨基己糖苷酶释放百分率。结果:与不同浓度的清开灵共培养后,细胞的脱颗粒有明显的差异,以1/8原浓度稀释后细胞脱颗粒明显,清开灵注射液使肥大细胞释放β-氨基己糖苷酶活性(A值)为0.828±0.004,β-氨基己糖苷酶活性为8.5%。结论:清开灵注射液能通过直接作用使RBL-2H3肥大细胞脱颗粒,为鉴定中药注射剂的过敏机制和临床前研究提供了一定的实验依据。